人工湿地中典型基质和关键微生物的脱氮作用研究进展

张 燕，董红云，李新华,2*，刘宏元，王娜娜，王艳君，李 英，贾 曦，陈为京

(1.山东省农业科学院湿地农业与生态研究所，山东省湿地生态农业工程实验室，山东 济南 250100；2.东营黄河三角洲现代农业研究中心，山东 东营 257000；3.山东省农业科学院 山东 济南 250100)

人工湿地是一种高效、低能耗、低投入、易操作、二次污染小和环境友好的污水处理工艺。人工湿地的脱氮效果非常显著[1]。人工湿地主要利用土壤、基质、植物、微生物的物理、化学和生物三重协同作用，实现污染水体修复的目标。其中，人工湿地中的基质和微生物在脱氮过程中起着关键作用。基质是人工湿地处理系统中至关重要的组成部分，也是人工湿地中植物生长和微生物附着的主要载体，并为其生长提供营养物质。人工湿地中的基质能通过物理吸附作用，去除污水中的铵态氮和磷酸盐等无机盐，也能通过化学反应去除污水中的氮、磷和重金属元素。为了提升基质去除废水中污染物的能力，开发了一些新型的经人工改造的基质[2-5]，例如，新型凹凸棒、铁碳电解基质、生物炭和纳米零价铁等。

在人工湿地中，微生物的除氮量占总除氮量的60%～86%[6-7]。在硝化、硝酸盐还原和厌氧氨氧化等作用过程中，氨氧化细菌/古菌、反硝化微生物和厌氧氨氧化菌等微生物促进了氮的迁移和转化[8-9]。因此，在人工湿地中，微生物群落的结构、功能和微生物活性直接影响系统的脱氮能力[10]。研究表明，人工湿地中的微生物数量越多，其对污水中氮的去除效果越好；单一植物物种根际的微生物群落利用碳源和去除污染物的能力都较弱，而多种植物组合系统根际微生物利用碳源和去除污染物的能力都较强；复氧能力较好的人工湿地系统中的微生物数量和活性都高于普通人工湿地系统，其脱氮效率较高，植物根系的输氧能力有利于基质层中好氧微生物的活动，如硝化微生物的活动，而在中、下层的缺氧或厌氧环境中，利于反硝化微生物和其他厌氧微生物的活动[11-12]。目前，多采用现代分子生物学技术，对人工湿地中关键微生物的活性和作用机理开展深入研究。

本文通过对大量相关文献的总结与分析，综述了人工湿地中典型基质和关键微生物的作用研究进展，重点分析了生物炭、纳米零价铁、生物炭负载纳米零价铁等基质和氨化、反硝化、厌氧氨氧化、厌氧铁氨氧化微生物等在人工湿地脱氮中的作用研究进展，梳理出人工湿地新型基质和关键微生物研究中存在的问题以及未来的研究方向，旨在为人工湿地去除污水中的氮提供理论指导与参考。

1 人工湿地中典型基质的脱氮作用

1.1 生物炭的脱氮作用

生物炭是秸秆、木头、锯末、粪便等生物质在缺氧环境中经高温裂解而形成的低密度、多孔含碳固体有机物。生物炭是一种新型廉价的吸附材料，为可再生资源，具有较大的比表面积，表面为多孔和芳香族化合物的结构，且富含羧基、酚羟基、内酯基等官能团，碳含量高达60%以上，具有良好的物质转换和吸附性能、很高的热稳定性和化学稳定性，可以在环境中长期保存而不被矿化，生物炭表面的官能团使其具备介导氧化还原反应的能力[13-14]，可以促进人工湿地系统去除污水中的氮和减小化学需氧量含量。同时，生物炭能为人工湿地系统补充碳源，促进反硝化反应[15]。

添加生物炭能改善人工湿地土壤的通透性，改变系统的溶解氧含量和pH 等，为土壤中的微生物提供良好的生存环境，增加土壤中的微生物数量，刺激微生物活性，影响微生物群落特性和结构[16-17]。生物炭具有良好的吸附能力，能吸附铵态氮等污染物，不仅提高了人工湿地系统的脱氮能力，还能减少人工湿地系统中氧化亚氮的产生[18-19]。为了进一步提高生物炭对污水中氮等污染物的去除效率，将生物炭负载钙和镁等金属离子，形成改性生物炭，提高了生物炭对污水中氮等污染物的去除率[20]。利用生物炭固定黄假单胞菌(Pseudomonas flavaWD-3)强化垂直流人工湿地，使人工湿地对低温废水中氮的去除效率显著提高[21]。通过生物炭和泥鳅协同强化垂直潜流人工湿地，使系统中硝化作用和反硝化作用都有所增强，促进了人工湿地中植物根的生长，增加了植物的总根长和体积，但是，随着添加的生物炭粒径的增大，反硝化作用强度降低[22]。利用生物炭和曝气协同强化垂直潜流人工湿地，处理低进水强度、低碳氮比的废水，有效提高了氮的去除率，减少了氧化亚氮的释放量，同时证实了这一强化措施适合处理中、低进水强度的低碳氮比废水[23]。随着生物炭添加量的增加，潜流人工湿地系统的氧化亚氮排放量减小[24]。研究表明，在高进水强度条件下，在人工湿地中添加生物炭能增加系统的氧化亚氮排放量[25]。目前，生物炭主要被应用于垂直潜流人工湿地中，很少被应用于水平潜流人工湿地中，尚未见利用添加生物炭的人工湿地处理含氮量高的畜禽养殖废水的报道。

1.2 纳米零价铁的脱氮作用

纳米零价铁(nonoscale zero-valent iron,nZVI)是指粒径尺度在1～100 nm 以内的零价铁粒子。纳米零价铁具有比表面积大、表面活性高、还原降解能力强、吸附性能好和价格低廉等优点，目前主要被用于去除污水中重金属、卤代有机物、偶氮染料等污染物[26-27]，其在人工湿地处理污水中的应用尚处于起步阶段。

纳米零价铁具有强还原能力，能将污水中的硝酸盐氮还原为氨氮，而自身被氧化成亚铁离子，又能通过氧化作用提供电子供体参与化学反硝化[28]，这在一定程度上减少了碳源的供给。纳米零价铁在厌氧腐蚀过程中产生的H2可以供反硝化细菌进行生物反硝化，在一定程度上解决了生物反硝化过程中电子供体缺失[3]的问题，使得纳米零价铁通过化学还原和生物反硝化过程提高了人工湿地对废水的脱色和脱氮能力，尤其是提高了对硝态氮的去除能力[29]。因为纳米零价铁提供了还原离子，所以降低了污染物的毒性[30]。将纳米零价铁应用于人工湿地，能对生活污水、畜禽养殖废水等高浓度废水起到强净化作用。而且，纳米零价铁的添加改变了人工湿地系统微生物群落的结构[31]，能将硝态氮还原为铵态氮，这有可能影响人工湿地系统中氨气和氧化亚氮等的排放。然而，尚缺乏有关纳米零价铁的添加对人工湿地系统的氨气和氧化亚氮等排放影响的报道。纳米零价铁颗粒的粒径小，反应活性极强，其稳定性较差，在水中极易团聚而影响其活性[3]。因此，可以通过将纳米零价铁负载于活性炭、生物炭、蒙脱石、膨润土等材料上，增大纳米零价铁颗粒的分散性，并克服其易氧化和易团聚等缺点，使纳米零价铁的应用领域拓宽。

1.3 生物炭负载纳米零价铁的脱氮作用

生物炭负载纳米零价铁是一种利用绿色生物原料、绿色合成、优良改性后的材料。生物炭负载纳米零价铁能降低去除水污染的材料成本，不易造成环境二次污染[32]，并且可以通过自身的吸附和还原等能力的协同作用，有效提高人工湿地系统对污染物的去除能力。生物炭负载纳米零价铁被广泛应用于去除污水中的有机物和重金属污染物等[33]。生物炭负载纳米零价铁同时具有生物炭和纳米零价铁的特性，在水体中，生物炭负载纳米零价铁的铁与碳之间能形成无数个微小的原电池，其中，铁为负极，碳为正极，这些原电池的形成有利于加快水中电子的传递，因而能够提高人工湿地系统的反应速度[34]。生物炭能明显增强微生物和零价铁厌氧的脱氮能力[35]。研究发现，生物炭负载纳米零价铁能有效去除污水中的硝态氮，而且其对硝态氮的去除能力显著高于纯生物炭和纯纳米零价铁，减少因硝态氮还原而产生的氨氮量，随着生物炭负载纳米零价铁中炭含量的增加，其对硝态氮的去除效率增大，产生的氨氮量相对较少，促进了对污水中总氮的去除，并且有效防止铁等引起的二次污染[36-37]。由于生物炭提高了纳米零价铁的分散度，使得生物炭负载纳米零价铁比纳米零价铁具有更广的pH 适应范围[29]，因此，其应用范围扩大。此外，虽然生物炭因负载纳米零价铁而使其比表面积小于生物炭，但是其比表面积随着生物炭含量的增加而增加，而利用铁炭质量比为1∶1的生物炭负载纳米零价铁去除污水中氮的效果较理想[37]。

由此可知，生物炭负载纳米零价铁是一种具有较大应用前景的氮净化材料。尽管生物炭负载纳米零价铁具有较多优点，但是，目前有关生物炭负载纳米零价铁对污水中氮去除效应的研究尚处于起步阶段，还无法诠释其作用机理，而且生物炭负载纳米零价铁作为填充材料添加到人工湿地中的应用实例尚未见报道。

2 人工湿地中关键微生物的脱氮作用

随着现代分子生物技术的迅速发展，对人工湿地中微生物的研究从传统的间接功能性测定发展到分子水平和基因测序水平。利用新技术，发现了在人工湿地中参与氮循环过程的部分微生物及其关键功能基因编码。

2.1 氨氧化微生物的脱氮作用

氨氧化微生物在人工湿地中普遍存在。氨氧化微生物的丰度、结构、多样性和代谢活性受到pH、溶解氧含量、氧化还原电位、氨氮含量等因素的影响[38-39]。氨氧化微生物在含氧量较高的基质表面和植物根区的数量较多[40]。利用即时聚合酶链锁反应和变性梯度凝胶技术研究发现，在水平潜流人工湿地中存在氨氧化细菌，但其活性没有确定[41]。通过即时聚合酶链锁反应技术发现，基质床的有氧环境的变化能导致人工湿地中氨氧化细菌和古菌的分布存在差异[42]。利用变性梯度凝胶技术对人工湿地处理奶牛场废水的研究结果显示，氨氧化细菌以Nitrosospira为主，实验期间，人工湿地系统内氨氧化细菌的优势种群未发生变化[43]。

2.2 反硝化和厌氧氨氧化微生物的脱氮作用

反硝化微生物在人工湿地中普遍存在。反硝化微生物的种类繁多，其丰度和多样性水平都较高。反硝化微生物能使氮元素以氧化亚氮或者氮气的形式脱离人工湿地系统[44]。在人工湿地脱氮过程中，反硝化微生物起主导作用。利用变性梯度凝胶技术研究反硝化微生物功能基因(nosZ)的多样性发现，人工湿地底泥中的碳、氮含量越大，反硝化细菌群落的结构越简单，优势种群更突出；水力停留时间越长，底泥中反硝化细菌群落的结构越复杂[40]。微生物的反硝化过程不仅能由反硝化细菌完成，而且真菌和古菌也能完成反硝化过程[45]。利用变性梯度凝胶电泳技术，研究处理畜禽养殖废水的人工湿地中的细菌群落时发现，人工湿地系统中存在厌氧氨氧化菌[38]。利用高通量测序技术的研究结果显示，厌氧氨氧化细菌在表面流人工湿地底泥中广泛存在，而且厌氧氨氧化细菌的脱氮量为0.83～2.68 kg/a氮，约占人工湿地氮去除总量的10%[46]。在水平潜流人工湿地中，也存在厌氧氨氧化细菌[47]。因此，为了更好地揭示水平潜流人工湿地中厌氧氨氧化细菌脱氮作用的机理，应该对其活性进行深入研究。

2.3 厌氧铁氨氧化微生物的脱氮作用

厌氧铁氨氧化过程是一种新发现的氮循环途径，在厌氧和富铁条件下，厌氧铁氨氧化微生物以三价铁为电子受体氧化铵态氮，同时被还原成亚铁离子的生物反应过程。厌氧铁氨氧化微生物普遍存在于河岸湿地、废水厌氧污泥和人工湿地基质中[48-50]。在氮的迁移转化过程中，厌氧铁氨氧化微生物发挥着重要作用。在自然界中，虽然存在多种铁还原菌，但是有关驱动厌氧铁氨氧化反应的铁还原菌的报道较少。借助即时聚合酶链锁反应、变性梯度凝胶技术、16S rRNA 基因检测技术和454焦磷酸测序技术开展的研究发现，在厌氧铁氨氧化反应中，酸微菌属(Acidimicrobiaceae)的Acidimicrobiaceae bacteriumA6起关键作用[51]。而且，在人工湿地中，Acidimicrobiaceae bacteriumA6能有效增加铵态氮的去除量[52]。通过即时聚合酶链锁反应技术和16S rRNA 基因检测技术发现，Geobacteraceaespp.和酸微菌Exiguobacteriumsp.B1 也能驱动厌氧铁氨氧化反应过程的进行[53-54]。由此可见，驱动厌氧铁氨氧化反应的功能微生物可能是多种菌种协同作用。

以上研究多针对单一类功能微生物群落和过程独立开展研究，尽管有些利用分子技术的研究结果表明，人工湿地系统内氮转化速率与氮转化基因存在明显的定量响应关系[55]，但是未对其做进一步研究。在人工湿地系统中，关键微生物群落同时存在，并且相互关联，而且人工湿地系统内氮转化过程之间存在多种耦合机制，因此，需要对人工湿地系统内的氮转化微生物群落及其功能基因开展联合研究，以深入探讨微生物脱氮作用的机理。例如，利用宏基因测序技术(基因芯片技术)，揭示硫循环调控电极生物膜-人工湿地系统中脱氮的微生物作用机制及其对环境因素变化的响应、适应和反馈机制，解析关键微生物综合脱氮机理[56]。然而，有关生物炭、纳米零价铁、生物炭负载纳米零价铁等新型基质强化人工湿地系统中关键微生物的现代分子生物学研究的报道很少，尤其是有关宏基因测序技术的应用研究，大多数研究集中在利用16S rRNA基因检测技术测序上。

3 结 语

基质的添加能改变人工湿地微生物群落的结构。人工湿地系统中的关键微生物在脱氮过程中相互关联，并且存在多种耦合作用机制。目前，人工湿地中的微生物脱氮作用的机理研究尚存在不足，仍需要利用多元现代分子生物学技术开展深入研究。在典型基质强化人工湿地脱氮的作用机理中，利用分子生物学技术，尤其将高通量测序技术和宏基因测序技术相结合，从微观角度深入解析人工湿地中典型基质的脱氮机理，能为优化人工湿地脱氮效应提供理论指导。