人参皂苷Rh2 对人肺泡上皮癌细胞A549上皮-间充质转化的影响及其机制研究

孟礼飞，赵伟军，李晨蔚，陈磊

上皮-间充质转化（EMT），即上皮细胞失去其上皮功能和特性，逐渐转变为间充质样细胞的过程[1-2]。EMT 是纤维化病理的基本标志，在伤口愈合和炎症中也被激活，反复应激诱导的EMT失调可能导致器官纤维化，因而有望成为慢性气道疾病新的临床治疗靶点[3]。近年来，有研究表明中医药作为治疗靶点可以稳定纤维化相关疾病，而人参作为一种中药已被证明通过其潜在的适应性特性对各种健康状况有用。人参皂苷是人参的主要活性成分，其中人参皂苷Rh2 属于人参皂苷，具有抗癌、抗炎及抗糖尿病等作用[4-6]。由于已经发现转化生长因子- 1（TGF- 1）诱导EMT，因此本研究观察人参皂苷Rh2 对TGF-1 诱导的EMT 的保护作用，现报道如下。

1 资料与方法

剂和苯基甲基磺酰氟（PMSF）裂解处理或转染A549细胞中的总蛋白，并用BCA protein kit 进行浓度测定。20l 裂解物用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）电泳，转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，室温下用5%脱脂牛奶封闭2 h，与一抗在4 ℃下孵育过夜，与二抗在室温下进一步培养1 h。使用三缓冲盐水间（TBST）洗涤三次膜，并通过增强化学发光蛋白质印迹法对底物进行可视化。使用Azure Imager c300 化学发光蛋白质印迹法系统对数据进行分析，并使用ImageJ 计算灰度值。二抗为过氧化物酶（HRP）偶联山羊抗兔IgG 抗体。

1.1 细胞试剂 A549（人肺泡上皮癌细胞系，购自中国科学院昆明细胞库）；DMEM培养基、FBS（美国Gbico 公司）；青霉素-链霉素（美国Gbico 公司）；I 型胶原V30（美国Gbico 公司）；人参皂苷Rh2 和3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基溴化四唑（MTT）（购自中国上海同田生物公司）；RIPA 缓冲液、TBST 缓冲液（购自美国Alfa 公司）；蛋白酶抑制剂、苯基甲基磺酰氟PMSF 和二甲基亚砜DMSO（购自中国上海生工生物公司）；TGF- 1（美国Sigma公司）；Western blotting 用一抗：GAPDH 和EMT 相关蛋白（购自英国Abcam公司）；二抗（购自美国Invitrogen,公司）；BCA 试剂（中国碧云天公司）。

1.2 细胞培养和处理 在人肺泡上皮癌细胞系A549 中添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的DMEM 培养基，在Forma™Steri-Cult™CO2培养箱中，37 ℃，5%CO2中维持。人支气管上皮细胞系BEAS-2B 保存在添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM中，湿度为5%CO2，温度为37℃。对于EMT诱导，A549 细胞在60 mm培养板中培养，涂有V30（I 型胶原），在含有1%FBS 的DMEM 中，37 ℃，5%CO2，过夜，然后用5 ng/ml TGF- 1 处理48和96 h。同时，为了确定人参皂苷Rh2 对A549 细胞的影响，先用5 ng/ml TGF- 1 作用48 h，然后用人参皂苷Rh2 以30、60 和90mol/L 作用48 h。两种处理96 h后，倒置光学显微镜在×200 倍放大镜下观察A549 细胞的形态。

1.3 细胞活力测定 3（-4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基溴化四唑（MTT）测定，将2×103个转染或未转染的A549 细胞置于96 孔板中，37 ℃，5%CO2培养，然后用TGF- 1 或人参皂苷Rh2 单独或联合处理。加入MTT 试剂孵育4 h。去除细胞培养液上清后，加入110l的甲醛溶液试剂二甲基亚砜DMSO，摇板10 min，使甲醛晶体溶解。使用Varioskam™LUX 多模微孔板读卡器测量并记录波长为490 nm处的光密度（OD）值。

1.4 免疫印迹 采用RIPA 缓冲液联合蛋白酶抑制

1.5 统计方法 采用SPSS20.0 统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析（ANOVA），两两比较采用LSD-t 检验。P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TGF- 1 作用后A549 细胞形态学变化及EMT相关因子表达情况 TGF- 1 作用96 h 后A549 细胞呈梭状，见图1a；通过western blot 检测EMT相关因子的表达，见图1b。TGF- 1 治疗后，N-钙黏蛋白、-SMA、纤维连接蛋白表达升高，E-钙黏蛋白表达降低（均P ＜0.05），见图1c；上述结果表明TGF-1 诱导的EMT 构建成功。

图1 TGF- 1 作用后A549 细胞形态学变化及EMT 相关因子表达情况

2.2 人参皂苷Rh2 对TGF- 1 作用后A549 细胞形态变化和活力的影响 人参皂苷Rh2 处理后使TGF- 1 处理的细胞数量减少，见图2a；同时，发现TGF- 1 对A549 细胞的活性有增强作用，而人参皂苷Rh2 对A549 细胞的活性有抑制作用（均P ＜0.05），见图2b。

图2 人参皂苷Rh2 对TGF- 1 作用后A549 细胞形态变化和活力的影响

2.3 人参皂苷Rh2 改善TGF- 1 对A549 细胞EMT相关因子表达的调控 TGF- 1 诱导A549 细胞的N-钙黏蛋白、-SMA 和纤维连接蛋白表达升高，E-钙黏蛋白表达降低。而人参皂苷Rh2（30、60 和90mol/L）处理TGF- 1诱导的A549 细胞48 h后，A549细胞中的E-钙黏蛋白表达上调，N-钙黏蛋白、-SMA和纤维连接蛋白表达下调（均P ＜0.05），见图3。

图3 人参皂苷Rh2 改善TGF- 1 对A549 细胞EMT 相关因子表达的调控

3 讨论

TGF- 1 是肌成纤维细胞分化和促纤维化微环境形成的主要生长因子[4]，已被发现不仅参与COPD和肺纤维化的发病机制，还参与被称为EMT的生物学过程[5-7]。EMT 的生物学过程，即上皮细胞向运动间充质细胞的转分化，被认为是发育、伤口愈合和干细胞行为的重要组成部分，在病理上促进了纤维化和癌症的进展，并受到包括E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、-SMA 和纤维连接蛋白在内的几个关键转录因子的调节和介导[8]。本研究不仅在A549 细胞中发现了梭状形态，而且再次证实了TGF- 1 对A549 细胞中N-钙黏蛋白、-SMA和纤维连接蛋白表达的促进作用以及对E-钙黏蛋白表达的抑制作用，表明体外EMT 模型构建成功。

作为最普遍的草本植物，人参已被指出具有多种药理活性，包括抗氧化应激，抗炎症，甚至抗癌作用[9-11]。人参皂苷Rh2 是人参皂苷的一个成员，已被发现并证明其在多种疾病中发挥作用[12-13]。本研究在肺泡上皮癌细胞A549 中证实了人参皂苷Rh2 对EMT 相关因子的影响，发现人参皂苷Rh2 对TGF-1 诱导EMT 相关因子的调节发挥了逆转作用。具体而言，本研究验证了人参皂苷Rh2 可提高TGF- 1处理细胞中E-钙黏蛋白的表达，降低N-钙黏蛋白、-SMA 和纤维连接蛋白的表达，并部分逆转TGF- 1诱导的肺泡上皮癌细胞A549 的形态学变化，这表明人参皂苷也可能对TGF- 1 诱导的肺泡上皮癌细胞A549 的EMT 具有保护作用。

综上所述，本研究证明了人参皂苷Rh2 对TGF-1 诱导的肺泡上皮癌细胞A549 EMT 的保护作用。虽然目前的研究并没有在小鼠体内模型中证实人参皂苷Rh2 对纤维化相关疾病的作用，这是本研究的局限性之一，但本研究有助于为研究和评价人参皂苷Rh2 通过抑制与纤维化相关疾病发生和进展奠定理论基础。此外，本研究结果可以从另一个角度证明中医在临床中预防和治疗纤维化相关疾病的应用，并为未来治疗纤维化相关疾病提供可能的方法。

利益冲突 所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明 孟礼飞：实验操作、论文撰写；赵伟军：数据整理、统计学分析；李晨蔚、陈磊：研究指导、论文修改、经费支持