miR-204-5p/TNFRSF12A轴对甲状腺乳头状癌细胞侵袭能力的影响及机制

喻洁，杨秋怡，易嘉宁，曾杰

[湖南省人民医院（湖南师范大学附属第一医院） 乳甲外科，湖南 长沙 410005]

方法：采用Transwell 实验检测miR-204-5p 过表达和敲低对PTC 细胞系TPC-1 细胞的侵袭能力影响；通过miRDB 网站预测miR-204-5p 下游靶基因，并采用Western blot 实验、Transwell 实验、GEPIA 数据库分析及双荧光素酶报告基因实验验证。

结果：Transwell 实验结果显示，过表达miR-204-5p 的TPC-1 细胞侵袭能力明显降低，而miR-204-5p 抑制的TPC-1 细胞侵袭能力明显增强（均P＜0.05）。miRDB 网站预测显示，TNFRSF12A 可能为miR-204-5p 下游靶基因；Western blot 结果显示，过表达miR-204-5p 的TPC-1 细胞TNFRSF12A 表达下调，而miR-204-5p抑制的TPC-1细胞TNFRSF12A表达上调；过表达TNFRSF12A的TPC-1细胞侵袭能力明显增强，TNFRSF12A抑制的TPC-1 细胞的侵袭能力明显降低；TNFRSF12A 可逆转miR-204-5p 对TPC-1 细胞侵袭能力的影响（均P＜0.05）。GEPIA 数据库分析显示，TNFRSF12A 在PTC 组织中高表达。双荧光素酶报告基因实验结果显示，TNFRSF12A 是miR-204-5p 的靶基因。

结论：miR-204-5p可靶向结合TNFRSF12A mRNA的3'UTR抑制TNFRSF12A的表达，而PTC细胞中miR-204-5p表达下调，削弱了其对TNFRSF12A 表达的抑制，从而导致PTC 细胞侵袭能力增强。

甲状腺癌是全球最常见的内分泌系统恶性肿瘤，已成为恶性肿瘤第8 位，为女性第4 位高发癌症，严重加重全球卫生负担，而甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲状腺癌的主要形式，约占所有甲状腺癌患者的80%～85%[1]。PTC 的主要特征之一是能够侵入邻近结构，例如淋巴管。大约有10%的患者在初诊时已经具有转移病灶。尽管大多数PTC 在生物学行为上表现良好，但由于其发病率和复发率均较高，仍严重威胁人类健康。随着对PTC 分子发病机制的深入研究，从基因水平探讨PTC 的分子机制，分析PTC 发生、发展过程中关键基因的改变，寻找更加有效的治疗靶点，对PTC 的预防及治疗至关重要。

microRNA（miRNA）是一类小型非编码RNA，能够识别特定目标mRNA 的3' 非翻译区域（3'UTR），并在转录后水平通过促进靶mRNA 的降解或抑制翻译过程而发挥负调控基因表达的作用。细胞内主要信号通路往往与关键miRNA 分子相互协调作用，促进肿瘤发展。Su 等[2]发现miR-200a 通过调节HIF-1α/VEGF 信号通路促进宫颈癌细胞增殖；Kim 等[3]发现miR-155 能驱动肿瘤细胞的增殖，其表达情况与乳腺癌患者的生存密切相关；Larson等[4]通过高通量的检测技术在前列腺癌中建立了与肿瘤恶性进展相关的基因和miRNA 调控网络；Chou 等[5]发现在肺癌中EGFR 信号可以通过Ras/ERK/Myc 信号通路诱导miR-7 的表达，而miR-7 通过其靶点EGFR 影响Akt 信号通路的活性；Nourmohammadi 等[6]发现在食道癌中miR-200c 可以通过Akt 信号通路使肿瘤对化疗产生耐药性；miR-21是一种致癌的miRNA，Dan 等[7]发现其在体外与乳腺肿瘤的生长和转移相关，而体内高水平的miR-21预示着乳腺癌患者预后不良，而下调miR-21 的表达可以改善乳腺癌的疾病进展。由此可见，miRNA分子参与了肿瘤细胞内信号转导网络的调控功能，对肿瘤的发生、发展和预后起到了关键性的作用。

通过前期查阅文献、数据[8]和笔者在PTC 细胞中相关分子表达验证发现，miR-204-5p 在PTC 中呈低表达，并可能作为关键分子在PTC 中发挥重要作用。因此，本研究进一步探讨miR-204-5p 对PTC侵袭能力影响的调控机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

选用PTC 细胞系TPC-1 细胞，根据细胞培养要求选用1640 培养基，并在培养基中加入10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素和1%谷氨酰胺，将细胞放置于5% CO2（v/v）的培养箱中孵育，设置温度为37 ℃。

1.2 qRT-PCR实验

收集细胞样本后，用TRIzol 法提取各组细胞总RNA，核酸定量仪检测RNA 的纯度和浓度。按照Invitrogen 公司“用于qRT-PCR 的M-MLV 第一链合成系统”操作说明，取1～3 μg 总RNA 建立20 μL逆转录体系合成cDNA。继之，使用Invitrogen 公司的“Platinum SYBR Green qPCRSuperMix-UDG with ROX”试剂盒和ABI 7500 Fast Real-time PCR 扩增仪进行荧光扩增。

1.3 Western blot实验

电泳胶由上层胶（浓缩胶）和下层胶（分离胶）组成，下层胶可根据不同分子量大小配置浓度不一，可分为15%、12%、10%、8%不等，上层胶浓度为5%。将配备好的胶嵌入电泳槽中，向槽内加满1x 电泳液，取出玻璃槽中的梳子，分别加入待测样本，在待测样本临近孔中加入1 μL Protein Marker，然后继续在电泳盒中加入电泳液。接通电源即开始电泳。然后通过转膜、封闭、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜后显影。将A、B显影液按1∶1 体积提前配备好，将PVDF 膜浸润显影液后，通过Bio-Rad 蛋白显影成像系统进行曝光处理。根据曝光后蛋白条带的清晰程度可手动调节曝光程序和曝光时间。

1.4 Transwell 侵袭实验

在24 孔板下室加入500 μL 含10%FBS 培养基。然后用镊子将Transwell 小室置于24 孔板内。每孔加入200 μL 细胞悬液到Transwell 上室中。培养箱培养24 h 后可进行固定染色。取出Transwell 小室，吸走培养基，用棉签轻轻擦拭Matrigengel 和上室内的细胞。在24 孔板干净的孔中加入4%多聚甲醛600 μL，将小室放入后固定20～30 min。弃去固定液，将小室在盛有PBS 的6 cm 皿中刷洗1 遍。用0.1%结晶紫染色5～10 min，PBS 刷洗3 遍，除去未与细胞结合的结晶紫，用棉签轻轻擦拭小室的上侧，将非特异性结合于小室上表面的染料擦掉，以便后续镜检。适当风干后，在10 倍显微镜下选取5 个视野观察细胞并计数。

1.5 双荧光素酶报告基因实验

通过miRDB 网站预测miR-204-5p 与TNFRSF12A 3'UTR 结合位点，然后分别构建TNFRSF12A 3'UTR野生型和突变型质粒，过表达miR-204-5p 和加入miR-204-5p 抑制剂后，采用双荧光素酶报告系统分别测量野生型和突变型TNFRSF12A 3'UTR 的荧光值。

1.6 统计学处理

每次实验都进行3 次重复，统计分析采用SPSS 19.0 统计软件。研究结果用均数±标准差（±s）表示，用单因素方差分析或t检验统计不同组间的差异。实验结果可视化分析用Graphpad软件。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-204-5p对PTC细胞侵袭能力的影响

Transwell 实验结果显示，过表达miR-204-5p后，TPC-1 细胞的侵袭能力减弱（图1A），而抑制miR-204-5p 表达后，TPC-1 细胞的侵袭能力增强（均P＜0.05）（图1B）。

2.2 miR-204-5p下游靶基因分析

通过生物信息学分析，TNFRSF12A 可能为miR-204-5p 调控的靶点，且可能为PTC 预后标志物[8]。有研究[9]显示，TNFRSF12A 与血管生成相关。先前的研究发现，血管生成对肿瘤的生长和进展至关重要。同时Tanaka 等[10]报道了血管生成和抗血管生成因子之间的平衡与PTC 的明显侵袭相关，提示了血管生成在PTC 中的重要性。故推测这两者与PTC 的发生发展有关联。为了进一步验证miR-204-5p 对TNFRSF12A 的调控，用Western blot 实验检验了过表达或抑制miR-204-5p 后PTC 细胞中TNFRSF12A 的表达情况，结果表明：过表达miR-204-5p 后TPC-1 细胞中TNFRSF12A 表达降低，抑制miR-204-5p 后TPC-1 细胞中TNFRSF12A 表达升高（均P＜0.05）（图2A-B）。进一步功能实验表明：TNFRSF12A 可增强TPC-1 细胞侵袭能力，而敲低TNFRSF12A 后TPC-1 细胞的侵袭能力减弱（均P＜0.05）（图2C-D）。同时，逆转实验表明过表达TNFRSF12A 可部分逆转miR-204-5p 对TPC-1 细胞侵袭能力的影响（均P＜0.05）（图2E）。同时，GEPIA数据库（http://gepia.cancer-pku.cn） 分析也表明TNFRSF12A 在PTC 组织中高表达（图2F）。

图2 miR-204-5p 下游靶基因分析 A：过表达miR-204-5p 后TPC-1 细胞TNFRSF12A 蛋白表达水平降低；B：加入miR-204-5p 抑制剂后TPC-1 细胞TNFRSF12A 蛋白表达水平增高；C：TPC-1 细胞过表达TNFRSF12A 后侵袭能力增强；D：TPC-1 细胞敲低TNFRSF12A 后侵袭能力减弱；E：TNFRSF12A 可逆转miR-204-5p 降低TPC-1 侵袭能力的作用；F：GEPⅠA 数据库分析表明TNFRSF12A在PTC组织中高表达

2.3 miR-204-5p对ATNFRSF12A的调控关系分析

为了在分子水平验证miR-204-5p 对TNFRSF12A的调控，进一步分析miR-204-5p 在TNFRSF12A 3'UTR 的潜在结合位点（图3A），使用双荧光素酶报告实验对该靶点功能进行了检测，结果表明，过表达miR-204-5p 降低了转染野生型TNFRSF12A 3'UTR TPC-1 细胞中的荧光素酶活性，而加入miR-204-5p 抑制剂增加了转染野生型TNFRSF12A 3'UTR TPC-1 细胞中荧光素酶的活性（均P＜0.05），而对突变型TNFRSF12A 3'UTR 无明显影响（均P＞0.05）（图3B）。

图3 miR-204-5p 对ATNFRSF12A 的调控关系分析 A：与miR-204-5p 相作用的野生型及突变型TNFRSF12A 3'UTR 序列；B：双荧光素酶实验验证转染野生型或突变型TNFRSF12A 3'UTR后，过表达或加入miR-204-5p抑制剂对TPC-1细胞的影响

3 讨 论

根据全球数据[11]表示，在过去的30 年间，甲状腺癌的发病呈爆发式增长，而PTC 约占所有甲状腺癌病例的85%左右。在碘缺乏或碘过量饮食的国家，它也是最常见的甲状腺癌亚型[12]。PTC 可发生在任何年龄[13-14]，其发病的平均年龄为40 岁，且发病率随着年龄的增长而增加，女性更为多见，比例为2∶1～4∶1[15]。PTC 的发病机制及原因尚不明确，可能与放射线接触史[16]、碘缺乏或遗传等因素[17]相关。进一步研究和探索PTC 发病的分子机制和潜在的治疗靶点对PTC 的预防和治疗有重要意义。

miRNA 通过抑制细胞质中mRNA 的翻译和（或）降解，以及改变细胞核中基因表达，在基因的转录调节中发挥关键作用[18]。miRNA 的失调已经被证实与多种疾病的发生与进展密切相关，与遗传分析相比，关于miRNA 作为PTC 生物标志物的应用的研究有很多。目前，已经有研究证实，与正常甲状腺组织相比，PTC 始终与特定miRNA（例如miR-146b，miR-221 和miR-222）的过表达有关。这些miRNA 的表达显然与指示肿瘤侵袭性的特征有关，例如甲状腺癌侵犯、复发、淋巴结或远处转移和BRAFV600E 突变等[19-20]。

笔者通过对相关的测序进行分析，筛选出了潜在研究靶点（miR-204-5p、miR-7-2、miR-146b、miR-222），然后通过在PTC 癌组织和细胞中进行验证，最终确定miR-204-5p 为研究对象，并通过侵袭实验验证了miR-204-5p 对PTC 细胞的影响，进一步证实了miRNA 在PTC 进展中的作用。由于目前研究的局限性，其他三种miRNA 在PTC 中的作用及分子机制仍需进一步实验证实。

结合到下游基因3'UTR 区域以此抑制下游基因的表达的转录后调控机制是miRNA 调控的最主要分子机制。以此为基础，结合相应的生物信息学分析数据，本研究筛选出了TNFRSF12A 可能作为miR-204-5p 调控靶点。 TNFRSF12A， 也被称为Fn14，它是TNF 受体超家族中包含细胞质死亡结构域的最小个体。有研究报道TNFRSF12A 在肝癌、肺癌等恶性肿瘤中表达升高，其水平的升高与临床病理分期、淋巴结转移相关[21-22]，TNFRSF12A 也被认为是促进前列腺癌骨转移的一个重要因素[23]，但它与PTC 的相关研究较少。本研究中发现TNFRSF12A 在PTC 组织中高表达，结合miR-204-5p在PTC 组织中低表达，预示着miR-204-5p 可能通过转录后调控抑制TNFRSF12A。本研究结果也证实了miR-204-5p 能通过结合TNFRSF12A 3'UTR 转录后调控其表达。

总之，miR-204-5p/TNFRSF12A 轴PTC 的侵袭与进展中起了重要作用，机制为PTC 细胞中miR-204-5p 表达下调，削弱了对TNFRSF12A 表达的抑制，从而导致PTC 细胞侵袭能力增强。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：曾杰实验设计、实验指导、审核和修改论文；喻洁、杨秋怡负责文献查阅、实验实施、数据收集和处理；喻洁、易嘉宁负责数据分析和解释；喻洁负责手稿写作。