乳腺癌循环肿瘤细胞微流控芯片检测研究进展

尉卓凡，宁智文，胡波，袁时芳

（1.中国人民解放军空军军医大学第一附属医院 甲乳血管外科，陕西 西安710032；2. 西安电子科技大学 生命科学技术学院，陕西 西安710126）

在世界范围内，乳腺癌已成为最常见的肿瘤，是女性癌症患者死亡的主要原因[1]，通过生物标志物早期识别其转移和复发情况至关重要。循环肿瘤细胞（circulating tumor cells， CTC） 最早由Ashworth 发现，其数量和生物学特征等包含着癌症进展和治疗反应的关键信息，被认为是转移性乳腺癌（metastatic breast cancer，MBC）的独立预后因素之一[2]。CTC 的检测为研究癌症转移提供了一种无创方法。作为CTC 临床应用研究最广泛的肿瘤之一，已经开发了各种针对乳腺癌CTC 的检测方法。然而，传统检测方法大多无法实现标准化的检测过程[3]，不完整不准确的检测结果限制了CTC在临床中的应用。与之相比，微流控芯片为CTC的全面研究带来了可能[4]，凭借在特异度、敏感度、通量、效率上的优势，微流控芯片具有将CTC实时检测应用于临床的巨大潜力。其中三维（3D）打印技术可实现标准化的微流控芯片制造，从而获取更多关于肿瘤有价值的信息，推动CTC 从指导肿瘤预后到预测肿瘤进展，为乳腺癌的精准治疗提供前所未有的机会。本文对基于不同原理的CTC 检测方法进行总结，着重分析了乳腺癌CTC 的微流控检测研究现状及进展，对3D 打印微流控芯片的广阔应用前景进行了展望。

1 常见的CTC检测方法与存在问题

外周血中的CTC 浓度非常低，大多数癌症患者每毫升血液中仅1～10 个CTC[5]，因此需要高敏感度和高特异度的技术来检测。根据CTC 区别于血细胞的独特性质，常见的检测方法大致可分为两类，即基于生物特性和基于物理特性的方法。

1.1 基于生物特性的方法

基于CTC 的生物学特征，通常利用附着在磁性物质表面的细胞表面标志物抗体等来筛选CTC。

阳性富集通过靶向CTC 表面的特异性抗原来实现，通常可实现高纯度富集。CellSearch 系统使用涂有上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）抗体的铁磁颗粒，对CTC 进行免疫磁分离并计数[6]，Cristofanilli 等[7]检测了177 例MBC 患者的血液样本后得到结论：每7.5 mL 血液中CTC≥5 个的患者，其无进展生存期（progression free survival，PFS）和总体生存期（overall survival，OS）更短。然而该方法易造成假阴性率高，现已停止生产和临床应用。另外，CTC 经上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT） 过程后会导致EpCAM 的下调或丢失[8]，从而逃避阳性富集系统，即使是使用多种抗体组合的AdnaTest，也无法完全解决CTC 抗原异质性导致的假阴性问题[9]。阴性富集策略往往通过抗体靶向、消耗外周血细胞，最常用的是抗CD45 抗体[10]，以高敏感度反向捕获缺乏充分表达EpCAM 的CTC。但单独使用此方法时往往降低了细胞纯度，故通常与其他方法结合使用，例如Wu 等[11]开发的CanPatrol 技术先裂解红细胞（RBC），再用磁珠消耗CD45+的白细胞（WBC），在乳腺癌患者血液样本中检测到CTC 及肿瘤微栓子。但是这种方法可能导致CK+/CD45+或“双阳性”细胞的CTC 被去除以致低估其数量[5]。常见的基于生物特性CTC 检测技术及其应用特点见表1。

表1 常见的基于生物特性CTC检测方法总结Table1 Summary of common CTC detection methods based on biological characteristics

1.2 基于物理特性的方法

CTC 以尺寸、密度、可变形性及介电性与血细胞相区别，一些技术据此可以快速分离富集CTC而无需标记。

Drucker 等[14]测试了几种方法，其中RosetteSep™使用抗体将血样中的PBMC 与RBC 交联形成免疫玫瑰花结，然后密度梯度离心将其去除，在MDA-MB-231 细胞加标实验中CTC 的捕获效率约为40%，在15/28 例MBC 患者的血样中检测到CTC，ScreenCell ™使用微滤器基于细胞大小差异分离CTC，在加标实验中表现为55%的回收率，并在8 例MBC 患者中的6 例检测到CTC，这两种设备在低至2 个CTC/mL 的水平下保证足够的敏感度。但此类方法容易忽略较小的CTC 和与WBC 具有相似变形能力的CTC，导致假阴性结果。密度梯度离心法利用了CTC 和WBC 的比重差异， 如Ficoll 法和OncoQuick 法，后者因结合了离心和过滤而具有更高的捕获率[15]。另外，基于CTC 与血细胞之间介电性差异， ApoStream®通过介电泳（dielectrophoresis，DEP）进行CTC 的富集[9]，Le Du等[16]在47 例乳腺癌患者的血样中检测CTC，并联合其他细胞标志物对CTC 进行染色区分3 种CTC 表型（上皮型、间质型、癌症干细胞样CTC）。此方法虽然可以分离出单个CTC，但处理效率较慢，且细胞纯度较低，电场亦会影响细胞表面活性和表面特征，影响后续分析[17]。

基于免疫亲和力的捕获方法虽然特异度很高，但受限于CTC 表面标志物的表达，迄今为止，CTC的异质性使其无法使用通用的特异性抗体来富集。而物理方法摆脱了靶向特定抗原的限制，未经抗体标记的CTC 也更利于后续表征分析，但离心、稀释等预处理步骤会损失部分CTC，捕获的CTC 纯度并不令人满意[18]。以上大多数CTC 检测技术非常耗时，需要熟练的操作人员和昂贵仪器。因此，需要开发新的检测技术，使CTC 的检测更加方便、准确和高效。常见的基于物理特性CTC 检测技术及其应用特点见表2。

表2 常见的基于物理特性CTC检测方法总结Table 2 Summary of common CTC detection methods based on physical characteristics

2 乳腺癌CTC的微流控芯片检测

微流控技术在CTC 检测中的应用出现于最近十几年，微流控技术以高通量和敏感度精确控制微米级的流体和细胞，旨在将所有实验室设备和功能集成到数十毫米尺寸的设备中，并以较低的成本和较短的分析时间对化合物进行微处理和微量分析。与传统方法相比，微流控芯片具有操作自动化、消耗样品少、敏感度高、通量大等优势，并可将过滤、离心、磁选等集成到微尺度中[20]。小型、集成化的微流控芯片实现了CTC 富集、分离和分析的一站式过程，显著减少了处理时间并提高捕获效率，为开发真正的即时诊断设备创造了可能。该技术对CTC 的检测方法大致可分为两类：基于标记的检测和无标记的检测。

2.1 基于标记的检测

基于标记的方法依赖免疫亲和原理，微流控芯片精确控制流体的流动速度和方向，通过影响CTC 表面抗原与抗体的相互作用从而直接影响捕获效率。针对不同的细胞表面抗原，此类方法可以进一步分为正向富集或负向富集。

2.1.1 正向富集 基于CTC 的抗原表达，正向富集法最常用的是EpCAM。Nagrath 等[21]制作的CTCChip 利用具有EpCAM 抗体涂层的微柱，使用不同类型肿瘤患者的全血样本中进行测试，在115/116 个样本中发现了CTC，其中乳腺癌患者（n=10）全血样本分离的CTC 数量为5～176 个/mL，捕获的平均纯度为60%。随后又进一步开发了人字形芯片（HB-Chip），通过产生微涡流使血细胞被动混合，增强了CTC 与抗体包被芯片表面之间的相互作用，其捕获效率比CTC-Chip 提升了26.3%。类似地，微柱阵列、混沌混合、几何增强混合和波浪人字形结构等微流控平台，凭借几何功能化微结构可优化免疫捕获效率[22-24]。例如借助混沌混合[23]和波浪形HB 芯片[24]的优点制作了T-μFS 微流体系统，将10～103个MCF-7 细胞加标于200 μL 全血中后捕获，效率为83.3%～94.2%，且细胞存活率为94.6%，这为完整、自动地捕获和释放高活性CTC 带来可能[25]。免疫磁泳法多用EpCAM 抗体偶联磁性纳米颗粒（magnetic nanoparticles，MNP），随后在磁场中富集与之结合的CTC。Wang 等[26]制备了含有抗EpCAM 抗体的水凝胶包被的MNP，将MCF-7 细胞加标入血液中模拟CTC 的捕获，效率约96%，同时检测了5 例癌症患者和5 名健康志愿者提供的血样，结果在患者血液样本中发现1～12 个CTC，而在健康血液样本中未检测到CTC，初步证明了其在临床实践中的实用性。同样，Wu 等[27]用中性粒细胞膜对免疫磁性纳米颗粒进行表面功能化得到Neu-IMNs，可以同时减少非特异性蛋白质的吸附和WBC 的干扰，并增强与CTC 的相互作用，成功从19/20 个乳腺癌患者血液样本中分离出具有高纯度和高活力的CTC，将其培养并进行了基因突变分析。正向富集依赖特定的标记物保证了高敏感度和纯度，然而一些低表达或不表达EpCAM 的“正常样”CTC[28]会减弱检测的敏感度，从而影响对肿瘤的监测和治疗效果的评估。

2.1.2 负向富集 负向富集靶向并去除背景细胞来实现CTC 的分离。Mishra 等[29]提出了LPCTC-iChip，以惯性分离阵列设备去除RBC 和血小板，结合高梯度磁性细胞分选仪去除WBC 并富集CTC，该团队将荧光标记的乳腺癌CTC 掺入健康供体的血样中，回收率为（89.2±5.7）%，并对其进行了分子分析。然而，此方法虽然降低了血细胞被误识别为CTC 的可能性，但分离纯度通常较低，因此通常需要多次分离过程[30]，而且磁场中背景细胞的移动可能会导致部分CTC 丢失[31]。此外，Szczerba等[32]发现CTC-WBC 簇的存在将增大乳腺癌转移的潜能，负向富集法可能会意外去除与WBC 相关的CTC。基于标记的技术常利用特异性抗体靶向捕获CTC，但这种方法受限于细胞的蛋白质表达。另外，由于抗体不可逆结合且不易降解，抗体标记也会影响CTC 的完整性和活力[33]，因此会影响后续分析。

2.2 基于无标记的检测

无标记法旨在减少使用特异性抗体而导致的误差，既不影响细胞活力和基因表达谱，更有利于CTC 的下游分析，并有望实现更高的捕获率[34]。其中主动分选需要借助外力，通常利用电场、磁场、声波或者光学驱动，而被动分选使用特定的通道结构、流体动力或空间位阻来检测CTC，常基于尺寸或惯性力进行分选。

2.2.1 主动分选 主动分选主要通过施加外力操纵细胞来分离CTC。基于细胞的电生理特性，DEP 利用介电粒子与电场之间的相互作用将CTC 分离、捕获[9,35]。Jahangiri 等[36]在AC-CSC 芯片上施加低频交流电场后，让不同表型的乳腺癌细胞系（MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468）分别通过AC-CSC 芯片，发现肿瘤细胞的极化程度相对更低，且不同表型的乳腺癌细胞有其特定的极化频率，同时，将MDA-MB-231 细胞与WBC 混合来模拟患者血液样本，捕获了约90% 的肿瘤细胞。Varmazyari 等[37]利用基于DEP 的微流控装置，在保证细胞活力的情况下将乳腺癌MDA-MB-231 细胞与WBC 分离，回收率和纯度分别接近95%和100%。类似地，不同细胞在声场下受到不同的力，据此也可将CTC 分选、富集[33]。例如，Zhang 等[38]将交变频率声场应用于微流控芯片，实现了从外周血单核细胞 （peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中无损分离三种不同的肿瘤细胞（MCF-7、A549、HCT116），即使在CTC 与PBMC 大小相近情况下也能实现有效分离，有效率高达95%，而PBMC 的污染率仅1%，为验证该方法的临床应用可能性，在4 例不同类型和阶段的癌症患者中进行测试，平均收集到75.5 个CTC/mL。光学微流体系统也可以用来分离CTC[39]。Hu 等[40]使用叶酸将同源RBC 与CTC 偶联，得到的CC-RBC 具有更大的体积和折射率，因此在光流体系统中的激光照明下可被精确分离，将人乳腺癌MCF-7 细胞添加到2 mL血样中测试，保持CTC 膜和功能的完整性的同时，达到92%的纯度和90%的回收率。

2.2.2 被动分选 在一项多中心临床试验[41]中，Parsortix®系统基于细胞大小差异富集CTC，对216 例MBC 患者和205 名健康志愿者的外周血进行测试，证明了该系统能够富集CTC 并进行后续下游分析，该系统已获得FDA 批准用于MBC 的CTC 富集。依赖物理屏障微结构的建模往往很困难，而利用流体动力学惯性效应，即可实现连续和精确控制流体而无需调节任何微观物理结构。Akbarnataj 等[42]使用具有梯形横截面的不同曲率半径的螺旋微通道，利用惯性升力结合迪恩涡流产生的拖拽力将CTC 聚焦于内部出口，在2.5 mL/min 的流速下实现90% 的效率，捕获的MCF-7 细胞高度存活。Zhu等[43]制造了PJMJ 微流体分选仪，将肿瘤细胞（A549、H460、MCF-7、H226 细胞）加标入WBC 中模拟临床样本，实现了90.57%～94.14%的高回收率和48.67%～79.05%的纯度，并且成功从MBC 和肺癌患者的血液样本中分离CTC，捕获率为每5 mL 样本7～226 个CTC，验证了其临床实用性。

无标记策略不会影响细胞活力及基因表达谱，更快的样品处理确保了较大通量，然而CTC 的异质性以及与背景细胞的重叠，导致其回收率和纯度并不令人满意。

3 新兴的集成技术及3D打印微流控芯片

目前，对CTC 的研究已经不限于单纯枚举数量，已有研究将基于各种原理的检测手段集成在微流控芯片中，结合各自的优势并实现互补，在有效分离和富集CTC 后对其进行分子表征，据此可以帮助阐明肿瘤转移机制、寻找治疗靶点及监测药物效应等[44]。

Wang 等[45]设计了一种楔形微流控芯片，用免疫微粒标记WBC 后在明场显微镜下区分CTC 并进行全自动化的计数、鉴定，将MCF-7、SK-BR-3 等细胞系掺入血液中，通过该芯片的形态识别可快速区分肿瘤细胞并进行捕获。Lee 等[46]基于免疫磁泳和荧光标记设计了Mag-Gradient 芯片，将MNP 与HER-2 结合，利用3 种生物标志物（HER-2、ER 和PR）的差异性表达，对4 种不同亚型乳腺癌细胞系（BT-474、SK-BR-3、MCF-7 和MDA-MB-231） 的混合物进行实验，借助磁场和免疫荧光信号完成乳腺癌CTC 捕获和分型。Green 等[47]使用一种双模块微流控设备PillarX，其中Pillar 装置基于细胞大小和可变形性，而X-磁装置使用偶联EpCAM 抗体的MNP，二者串联来捕获CTC 簇和单个CTC，除使用MDA-MB-231 荷瘤小鼠进行测试外，在6 例MBC患者的血样（500 μL）中成功检测出CTC（12～79 个）和CTC 簇（5～16 个）。Schwab 等[48]制造的MyCTC 芯片，能够在同一集成化设备中对肿瘤细胞进行捕获、培养扩增和药物敏感性测试，在加标癌细胞系样本中的回收率分别为95%～98%和97%～99%，并且成功在1 例MBC 患者血液样本中捕获了单个CTC 和CTC 簇。Lv 等[49]设计了一种近红外（near infrared，NIR）光响应微流控芯片，并通过侧流微阵列（lateral flow microarray，LFM） 芯片和光热响应系统的组合，在保证高活性的前提下实现单个CTC 的捕获和无损释放，将MCF-7 细胞加标到全血中以模拟患者血液样本， 捕获的纯度为（90±2）%。

传统的微流控设备基于光刻的制造工艺，复杂的制造步骤、昂贵的材料成本、耗时的制作过程均限制了微流控设备从实验室到实际临床实施的转化[50]。与之相比，3D 打印技术具有相对灵活性、直接性和快速原型制作的能力，能够逐层打印出多种复杂的三维结构，增加了微流控芯片的功能表面积，为精确和小型的微流控芯片制造提供便利[51]，此外，各种适宜的原材料的出现将不断丰富微流控设备的应用范围，促进其在研究和临床环境中被广泛接受。

Chen[52]等提出了一种3D 类河湾截面微流控芯片，主要利用剪切梯度升力与迪恩曳力实现CTC的惯性聚焦及富集，将荧光标记的人乳腺癌MDAMB-231 细胞掺入兔全血进行实验，其最佳回收率和富集比分别可达到95.0%和1.90。本课题组[53]使用4 台商用3D 打印机设计并打印了矩形截面蛇形微流控芯片模型，模拟确定了最佳通道曲率和流速并成功聚焦MCF-7 细胞。最近，Chu 等[54]借助3D打印技术将WBC 捕获通道和微滤装置结合在同一微流体设备中，利用抗CD45 抗体捕获WBC，同时用过滤器耗竭RBC、血小板等，由此分离富集CTC，将人乳腺癌MDA-MB-231 细胞掺入健康志愿者提供的全血中测试设备性能，肿瘤细胞的平均恢复率为91.4%，并且保持了完整性及活力，也在转移性肿瘤患者（前列腺癌、胰腺癌）的外周血样本分离出CTC，表明该装置适用于不同的临床情境。

3D 打印微流控芯片可以为CTC 检测和早期监测肿瘤转移开辟新机会，可以预测，3D 打印技术在未来将会成为微流控芯片制造领域最为重要方法之一，为CTC 检测广泛应用于临床提供有益的见解。

4 总结与展望

CTC 的检测可以为乳腺癌的进展提供有价值的临床见解，监测患者在治疗期间的反应并为治疗方案的制定提供参考。微流控技术以其成本低廉、操作简单、试剂消耗少、小型化、快速等独特优势，越来越多地应用于CTC 分离、鉴定和表征的各项研究中。3D 打印技术凭借设计灵活性，克服了微流控设备功能表面积有限的不足，为微流控芯片制造提出了一种更优方案。在未来，期望微流控芯片将常规用于CTC 的即时检测，这对研究乳腺癌及其转移机制的研究具有重要意义，将在癌症的早期诊断、预后的观察，以及患者的个性化治疗方面发挥关键作用。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：尉卓凡负责调研整理文献，设计论文框架，论文撰写，根据修改意见进行论文修订；宁智文负责调研整理文献，对论文中微流控等专业领域部分做出修改解释；胡波负责协助确定研究选题，提供相关研究材料支持，论文修订，对微流控领域相关知识提供见解与指导；袁时芳提出并确定研究选题，确定论文结构框架，明确论文撰写内容，论文修订，给予指导性意见。