白藜芦醇对小鼠甲状腺乳头癌细胞移植瘤的抑制作用及机制研究

毛姗，李扬，丁韩梦，赵永丽

（1.南阳医学高等专科学校 药学系，河南 南阳 473000；2. 南阳张仲景医院 药剂科，河南 南阳 473000）

方法：将40 只裸鼠背部皮下接种甲状腺乳头状癌细胞（TPC-1）悬液建立移植瘤模型后，随机分为模型对照组和3 个不同剂量白藜芦醇（2.5、5、10 mg/kg）治疗组，每组10 只。白藜芦醇各剂量组裸鼠分别腹腔注射相应剂量的白藜芦醇，模型对照组裸鼠腹腔注射等体积生理盐水，1 次/d，连续21 d。记录移植瘤的生长情况，绘制生长曲线。21 d 后处死各组小鼠，称量肿瘤质量，计算抑瘤率；行肿瘤组织HE 染色和TUNEL 染色检测肿瘤细胞形态和凋亡情况；用qRT-PCR 法与Western blot 法分别检测肿瘤组织中凋亡相关蛋白（caspase-3、Bax、Bcl-2）与上皮-间充质转化（EMT）相关分子（E-cadherin、N-cadherin、vimentin）的mRNA 与蛋白表达。

结果：与模型对照组比较，3 个剂量白藜芦醇治疗组的移植瘤生长速度均被抑制，21 d 后的移植瘤质量均明显减小，且抑瘤率随白藜芦醇剂量的增加而加大（均P＜0.05）。HE 染色结果显示，模型对照组肿瘤组织中癌细胞呈片状，形态大小不一，胞浆丰富，核大，可见核分裂象，极性紊乱；3 个剂量白藜芦醇治疗组细胞数量均不同程度减少、细胞排列疏松、细胞核固缩、核分裂较少、不同程度片状坏死。与模型对照组比较，3 个剂量白藜芦醇治疗组的肿瘤组织中肿瘤细胞凋亡增加；E-cadherin 和Bax mRNA 和蛋白表达量升高，N-cadherin、vimentin 和Bcl-2 mRNA 和蛋白表达量降低；caspase-3 mRNA水平降低，切割型caspase-3 蛋白表达量升高，且以上变化在3 个剂量白藜芦醇治疗组均呈剂量依赖性（均P＜0.05）。

结论：白藜芦醇可促进甲状腺癌细胞凋亡从而抑制其在小鼠体内的生长，其作用机制可能与逆转EMT过程有关。

甲状腺癌是内分泌系统常见恶性肿瘤，其发病具有隐匿性，多数患者因无痛性颈部肿块就诊，部分患者伴有呼吸困难、声音嘶哑等，且极易侵袭颈部淋巴结，发生远处转移[1-2]。目前全球范围内甲状腺癌的发病率呈逐年上升趋势，但是对其发病的具体机制尚不清楚，临床上根据其病理类型主要分为乳头状癌、滤泡状癌、未分化癌和髓样癌，其中以乳头状癌最为常见[3-5]。因此，寻找有效治疗甲状腺癌的药物具有重大意义。

上皮- 间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮表型细胞在一定刺激因素下丧失上皮特性，逐渐获得间质细胞特性的现象，间质细胞处于运动状态，从而具有更强的迁移和侵袭能力，该过程具有一定可逆性，可能成为治疗癌症的重要机制[6-7]。研究[8]已证实，在甲状腺癌侵袭和转移的过程中，EMT 起到了十分重要的作用。

白藜芦醇是一种广泛存在于植物中的多酚类化合物，具有抗炎、抗氧化以及调节免疫系统等多种药理学作用[9-11]。研究[12-15]表明，白藜芦醇在卵巢癌、口腔鳞状细胞、宫颈癌以及乳腺癌等恶性肿瘤中均发挥抗癌作用。此外，白藜芦醇在抑制甲状腺癌细胞增殖、迁移中的作用在近几年偶有报道[16]。

基于以上背景，本研究探讨白藜芦醇对甲状腺癌移植瘤的抑制作用以及与EMT 过程的关系。

1 材料与方法

1.1 实验材料

甲状腺乳头状癌细胞系TPC-1 购自美国ATCC公司；SPF 级雌性BALB/c 裸鼠40 只，6～7 周龄，体质量15～20 g，购自北京维通利华实验动物科技有限公司（许可证号：SCXK（京）2021-0006）；白藜芦醇（纯度≥98%）购自上海源叶生物科技有限公司；RPMI-1640 培养基购自美国Gibco 公司；苏木素-伊红染色（HE）染色和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 原位切口末端标记（TUNEL）染色试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司；引物序列由广州锐博生物科技有限公司合成；逆转录试剂盒、荧光定量PCR 试剂盒以及TRIzol 试剂购自北京索莱宝生物科技有限公司；Varioskan LUX多功能酶标仪购自赛默飞世尔科技；Z136115 型游标卡尺购自西格玛奥德里奇贸易有限公司；QuantStudioTM 5 型荧光定量PCR 仪购自赛默飞世尔科技。

1.2 实验方法

1.2.1 移植瘤裸鼠模型构建 TPC-1 细胞复苏后培养于含10%胎牛血清、1%青链双抗的RPMI-1640培养基中，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中，每天更换1 次新鲜培养基，细胞融合度达到80%时进行传代。取对数期细胞消化，调整细胞浓度为2×107/mL。取0.2 mL 细胞悬液注射于小鼠背部皮下，注射5 d 后可见明显肿块视为模型制备成功。

1.2.2 实验分组与给药 将模型制备成功裸鼠随机分为模型对照组和低、中、高3 个不同剂量白藜芦醇（2.5、5、10 mg/kg）治疗组，每组10 只。3 个白藜芦醇治疗组分别腹腔注射1 mL 浓度为2.5、5、10 mg/kg 的白藜芦醇，模型对照组给予等体积生理盐水，1 次/d，连续21 d。

1.2.3 肿瘤生长情况检测 自接种后5 d 起，每隔3 d 使用游标卡尺测量肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积=长径×短径×短径/2，并绘制肿瘤生长曲线。给药结束后，颈椎脱臼法处死，切开背部皮肤，将肿瘤组织快速完整剥离下来，称取肿瘤质量，计算抑瘤率（%）=（模型对照组肿瘤质量-各药物组肿瘤质量）/模型对照组肿瘤质量×100%。

1.2.4 肿瘤组织HE 染色 取一半肿瘤组织置于4%多聚甲醛中固定，常规脱水、石蜡包埋、切片，进行HE 染色，光学显微镜下观察肿瘤组织形态学变化。

1.2.5 肿瘤组织TUNEL 染色 取石蜡切片，组织上滴加蛋白酶K 工作液，孵育30 min，洗涤，滴加3%过氧化氢封闭液封闭，滴加TdT 酶反应物置于湿盒中避光孵育1 h，HRP 标记的链霉亲和素50 μL 避光孵育，DAB 显色，苏木素复染，中性树胶封片，光学显微镜下观察并计数凋亡细胞数，凋亡细胞呈棕黄色，计算凋亡指数（AI）=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.2.6 RT-PCR 法检测肿瘤组织中EMT 和细胞凋亡相关蛋白mRNA 表达水平 取100 mg 肿瘤组织置于EP 管中，剪碎，匀浆，TRIzol 试剂提取总RNA，紫外分光光度计测定RNA 浓度和纯度。根据逆转录试剂盒将RNA 逆转录成cDNA，以cDNA 为模板，构建荧光定量PCR 反应体系，设置反应条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，进行35 个循环，2-ΔΔCT法计算目的基因mRNA 水平，引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.7 Western blot 检测肿瘤组织中EMT 和细胞凋亡相关蛋白表达水平 取100 mg 肿瘤组织剪碎，匀浆，裂解液裂解。4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，吸取上清液提取蛋白，加入5×上样缓冲液，裂解液调整蛋白浓度，煮沸变性。取50 μg 蛋白样品用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白湿转至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上，封闭，抗体（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，滴加发光液，凝胶成像分析仪显影，Image J 分析条带灰度值，计算蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值。

1.3 统计学处理

用SPSS27.0 软件进行数据分析，符合正态分布的定量资料以均数±标准差（±s）表示，多样本间比较采用单因素方差分析，两样本间比较采用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 白藜芦醇对肿瘤生长的影响

由移植瘤生长曲线可见，从接种肿瘤细胞的第10 天开始，4 组小鼠体内的移植瘤生长速度有明显差异。与模型对照组比较，3 个剂量白藜芦醇治疗组的移植瘤生长速度均被抑制，且呈剂量依赖趋势（图1）。在接种21 d 后，模型对照组与低、中、高剂量白藜芦醇治疗组的移植瘤质量分别为（2.52±0.36） g、（2.03±0.21） g、（1.36±0.23） g、（1.01±0.20） g，各组间差异均有统计学意义（均P＜0.05）；3 个剂量白藜芦醇治疗组的抑瘤率随着白藜芦醇剂量的增加而升高（均P＜0.05）（图2）（表2）。

图1 各组小鼠移植瘤生长曲线Figure1 The growth curves of transplanted tumors in each group of mice

图2 各组移植瘤大体标本Figure 2 Gross specimens of transplanted tumors in each group

表2 各组肿瘤质量和抑瘤率比较（n=10，±s）Table 2 Comparison of tumor mass and tumor inhibition rates among groups (n=10, ±s)

表2 各组肿瘤质量和抑瘤率比较（n=10，±s）Table 2 Comparison of tumor mass and tumor inhibition rates among groups (n=10, ±s)

注：1）与模型对照组比较，P＜0.05；2）与低剂量白藜芦醇治疗组比较，P＜0.05；3）与中剂量白藜芦醇治疗组比较，P＜0.05Note: 1) P＜0.05 vs. model control group; 2) P＜0.05 vs. low-dose resveratrol treatment group; 3) P＜0.05 vs. medium-dose resveratrol treatment group

抑瘤率（%）—31±3.22 41±3.192）55±4.442），3）组别模型对照组低剂量白藜芦醇治疗组中剂量白藜芦醇治疗组高剂量白藜芦醇治疗组肿瘤质量（g）2.52±0.36 2.03±0.211）1.36±0.231），2）1.01±0.201），2），3）

2.2 肿瘤组织病理染色结果

模型对照组肿瘤组织中癌细胞呈片状，形态大小不一，胞浆丰富，核大，可见核分裂象，极性紊乱；白藜芦醇低、中和高剂量组细胞数量不同程度减少，细胞排列疏松，细胞核固缩，核分裂较少，不同程度片状坏死（图3）。

2.3 肿瘤细胞AI检测结果

与模型对照组比较，3 个剂量的白藜芦醇治疗组的AI 均明显升高，且在3 组间呈明显的剂量依赖性（均P＜0.05）（图4）（表3）。

图4 肿瘤组织TUNEL染色（×200）Figure 4 TUNEL staining of tumor tissues (×200)

表3 各组肿瘤组织中AI比较（%，n=10，±s）Table 3 Comparison of AI in tumor tissues among groups(%, n=10, ±s)

表3 各组肿瘤组织中AI比较（%，n=10，±s）Table 3 Comparison of AI in tumor tissues among groups(%, n=10, ±s)

注：1）与模型对照组比较，P＜0.05；2）与低剂量白藜芦醇治疗组比较，P＜0.05；3）与中剂量白藜芦醇治疗组比较，P＜0.05Note: 1) P＜0.05 vs. model control group; 2) P＜0.05 vs. low-dose resveratrol treatment group; 3) P＜0.05 vs. medium-dose resveratrol treatment group

AI 9.20±0.75 18.37±2.331）29.66±6.081），2）41.73±9.951），2），3）组别模型对照组低剂量白藜芦醇治疗组中剂量白藜芦醇治疗组高剂量白藜芦醇治疗组

2.4 qRT-PCR检测结果

与模型对照组比较，3 个剂量白藜芦醇治疗组的E-cadherin 和Bax mRNA 表达水平均明显升高，而N-cadherin、vimentin、caspase-3 和Bcl-2 mRNA 表达水平均明显降低，且呈明显的剂量依赖性（均P＜0.05）（表4）。

表4 各组肿瘤组织中EMT和凋亡相关蛋白mRNA表达水平比较（n=10，±s）Table4 Comparison of mRNA expression levels of EMT and apoptosis-related proteins in tumor tissues among different groups (n=10, ±s)

表4 各组肿瘤组织中EMT和凋亡相关蛋白mRNA表达水平比较（n=10，±s）Table4 Comparison of mRNA expression levels of EMT and apoptosis-related proteins in tumor tissues among different groups (n=10, ±s)

注：1）与模型对照组比较，P＜0.05；2）与低剂量白藜芦醇治疗组比较，P＜0.05；3）与中剂量白藜芦醇治疗组比较，P＜0.05Note: 1) P＜0.05 vs. model control group; 2) P＜0.05 vs. low-dose resveratrol treatment group; 3) P＜0.05 vs. medium-dose resveratrol treatment group

组别模型对照组低剂量白藜芦醇治疗组中剂量白藜芦醇治疗组高剂量白藜芦醇治疗组Bcl-2 1.03±0.15 0.82±0.061）0.70±0.041），2）0.57±0.051），2），3）E-cadherin 1.03±0.45 3.71±0.441）5.06±0.621），2）6.78±0.691），2），3）Bax 1.07±0.56 3.95±0.721）5.38±0.691），2）7.20±0.651），2），3）caspase-3 1.05±0.14 0.77±0.051）0.60±0.041），2）0.47±0.061），2），3）N-cadherin 1.08±0.27 0.78±0.031）0.62±0.041），2）0.51±0.061），2），3）vimentin 1.12±0.56 0.82±0.051）0.67±0.061），2）0.52±0.071），2），3）

2.5 Western blot检测结果

与模型对照组比较，3 个剂量的白藜芦醇治疗组的E-cadherin、Bax 和切割型（cleaved） caspase-3蛋白表达量均明显升高，而N-cadherin、vimentin和Bcl-2 蛋白表达量均明显降低，且呈明显的剂量依赖性（均P＜0.05）（图5）。

图5 各组肿瘤组织中EMT和凋亡相关蛋白表达量比较 1）与模型对照组比较，P＜0.05；2）与低剂量白藜芦醇治疗组比较，P＜0.05；3）与中剂量白藜芦醇治疗组比较，P＜0.05Figure 5 Comparison of protein expression levels of EMT and apoptosis-related proteins in tumor tissues among different groups 1) P＜0.05 vs. model control group; 2) P＜0.05 vs. low-dose resveratrol treatment group; 3) P＜0.05 vs. mediumdose resveratrol treatment group

3 讨 论

女性甲状腺癌发病率高于男性，其发病受辐射、空气质量、碘摄取异常、情绪、遗传等多种因素的影响，而且年龄、肿瘤直径、多发癌灶、腺外侵犯等多种因素可导致癌细胞发生颈区淋巴结转移[17-18]。临床上主要采用以手术切除为主的综合治疗手段，预后良好，但部分患者因身体条件、耐药性等因素而未能达到令人满意的预后效果[19-20]。近些年，中草药因其来源广、成本低、毒副作用小以及多靶点等优势被广泛应用于肿瘤领域的研究。于彬等[21]报道扁蒴藤素可抑制肝癌细胞增殖和迁移，降低吉西他滨化疗耐药性。青藤碱可抑制胰腺癌细胞迁移和侵袭，发挥抗胰腺癌作用[22]。白藜芦醇抗肿瘤特性被广泛研究。本研究以甲状腺最常见的病理类型乳头状甲状腺癌移植瘤裸鼠为研究对象，探讨白藜芦醇对肿瘤生长的抑制作用及其具体机制。

移植瘤裸鼠腹腔注射药物21 d 后，3 个剂量白藜芦醇治疗组肿瘤体积均减小，具有显著抑瘤率。模型对照组肿瘤组织中癌细胞呈片状，形态大小不一，胞浆丰富，核大，可见核分裂象，极性紊乱；3 个剂量白藜芦醇治疗组细胞数量不同程度减少，排列疏松，细胞核固缩，核分裂较少，不同程度片状坏死。此外，通过染色发现3 个剂量白藜芦醇治疗组肿瘤组织中凋亡细胞增多，AI 升高。以上结果提示，白藜芦醇可抑制甲状腺乳头状癌细胞在裸鼠体内的生长，诱导癌细胞凋亡。此结果与Li 等[23]报道的白藜芦醇可抑制前列腺癌移植瘤生长、诱导癌细胞凋亡具有一致性。恶性肿瘤的进展与细胞凋亡异常失控具有必然联系，细胞凋亡是多基因共同作用的结果，Bcl-2 家族是调控细胞凋亡的重要途径之一。Bcl-2 可调节线粒体通透性保护细胞免受程序性细胞死亡，而该家族中的另一成员Bax 则发挥与Bcl-2 相反的作用，表现为促进细胞凋亡[24-25]。caspase-3 家族是细胞凋亡信号网的重要节点，在调控细胞凋亡的多途径中扮演凋亡执行者的角色，通过选择性切割某些蛋白质造成细胞凋亡[26]。在本研究中白藜芦醇低、中和高剂量治疗组裸鼠甲状腺乳头状癌移植瘤组织中Bax 和caspase-3 mRNA 和蛋白表达水平高于模型对照组，Bcl-2 mRNA 和蛋白表达水平低于模型对照组，该结果提示白藜芦醇在甲状腺乳头状癌移植瘤中发挥促进促凋亡蛋白表达，抑制抗凋亡蛋白表达的作用。

EMT 获得的间质细胞是恶性肿瘤发生转移和侵袭的重要原因，逆转EMT 过程或是降低恶性肿瘤转移和复发的重要机制之一[27-28]。研究[29]发现，白藜芦醇通过抑制TGF-β1 诱导的EMT 过程发挥抗胃癌作用。Yuan 等[30]报道称白藜芦醇可逆转EMT过程抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭。EMT 过程的明显特征是E-cadherin 丢失， N-cadherin 和vimentin 的增加。因此在本研究中白藜芦醇低、中和高剂量治疗组裸鼠肿瘤组织中E-cadherin mRNA和蛋白表达较模型对照组升高，N-cadherin 和vimentin mRNA 和蛋白表达水平较模型对照组降低。此结果提示白藜芦醇可逆转EMT 过程。

综上所述，白藜芦醇可抑制甲状腺乳头状癌细胞移植瘤裸鼠肿瘤生长，诱导癌细胞凋亡，其可能是通过逆转EMT 过程、调节凋亡相关蛋白表达发挥作用。以上结果为临床治疗甲状腺癌提供理论依据。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：毛姗负责课题设计，李扬负责实验操作，丁韩梦负责数据统计与分析，赵永丽负责撰写文稿。