建兰MYB基因家族鉴定及在盐胁迫下的表达分析
2023-12-22邓文楷彭艳杨成李婷婷潘贵英
邓文楷 彭艳 杨成 李婷婷 潘贵英
摘要：植物MYB家族是最大的转录因子家族，在植物胁迫反应中起着重要作用。基于全基因组分析，对建兰（Cymbidium ensifolium）MYB家族成员进行鉴定和生物信息学分析，并分析相关基因在不同盐胁迫类型下的表达情况。结果表明，从建兰基因组中共鉴定出136个CeMYB转录因子，包括27个1R-MYB、102个R2R3-MYB、5个3R-MYB和2个4R-MYB。通过与拟南芥MYB进行系统发育得到20个基因簇，表明这些CeMYB可能具有多种生物学功能。亚细胞定位、染色体定位及保守域显示，136个CeMYB分布在18条染色体上，大多数CeMYB位于细胞核中，且具有典型的氨基酸序列重复；基序预测分析表明，多个保守元件主要位于CeMYB的N端，表明它们的功能相对保守。转录组表达分析表明，S13亚家族的CeMYB61和CeMYB89可能是调控盐胁迫的关键基因，qRT-PCR验证进一步表明，CeMYB61、CeMYB89在不同组织中表现为根系>假鳞茎>叶片>花序，其表达水平、模式与植株Na+浓度分布一致，证实CeMYB61、CeMYB89是建兰耐受盐胁迫的指示基因。研究为进一步探索MYB基因的潜在机制及盐胁迫下候选基因的挖掘提供了理论基础。
关键词：建兰；MYB转录因子；盐胁迫；基因组；qRT-PCR
中图分类号：S682.310.1文献标志码：A
文章编号：1002-1302（2023）21-0019-10
建兰（Cymbidium ensifolium）是中国栽培历史悠久的传统兰花种类之一，因其香气馥郁、花姿优美等优点具有较高的观赏价值，深受消费者喜爱［1］。水分、温度等环境皆会影响建兰的生长发育及体态建成［2］，且近期研究表明，由于野外氮沉降或室内施肥方式导致的盐胁迫已成为影响兰花生长与栽培的重要非生物因素［3］。在绿色植物中，盐对植物体的影响可贯穿植物生长史的各个发育时期，研究表明盐胁迫可对叶绿体光化学反应产生不利影响［4］，导致气孔关闭、胞间CO2浓度增加，此外可导致离子稳态失衡、激素代谢紊乱及DNA突变等［5］。在非生物胁迫反应中发掘候选基因和剖析信号机制，是应对植物非生物胁迫的关键策略。
MYB家族是数量最多的转录因子家族之一，广泛分布于高等植物的基因组中；MYB家族的共同特征是具有高度保守的DNA结合结构域，在其N末端由1～4个不完整的重复序列构成［6］。这些重复序列包含3个保守的色氨酸残基并编码3个α-螺旋和1个与DNA结合的螺旋-转角折叠结构［7］。而C末端区域是一个高度不一致的激活域，从而广泛调控MYB的功能表达［8］。根据MYB不完全串联重复序列（R）的数量和位置，可将MYB家族成员分为4个亚家族，即1R-MYB蛋白（含有1个R结构域）、R2R3-MYB蛋白（含有2个R结构域）、R3-MYB 蛋白（包含3个R结构域）和4R-MYB蛋白（包含4个R1和/或R2结构域）［9］。一般来说，具有2个重复序列的MYB成員是高等植物中的主要形式（即R2R3-MYB），同一植物的不同基因型间R2R3-MYB成员的基因拷贝数可能存在5倍差异［10］。
自植物MYB基因被表征以来，已经在许多植物物种中发现了MYB家族成员，如烟草（Nicotiana tabacum）［11］、玉米（Zea mays）［12］、三七（Panax notoginseng）［7］和苹果（Malus pumila）树［13］。且研究证实，MYB蛋白在生理代谢、细胞分化、激素合成及信号转导等生理功能中发挥着重要作用［14］。此外，MYB蛋白在调节植物的非生物胁迫反应中也发挥着至关重要的作用［15］。多项研究表明，靶向MYB基因的过表达可增强植物的非生物胁迫耐受性，包括拟南芥中的AtMYB20［16］、白桦树中的BpIMYB46［17］及水稻中的OsMYB6［18］。尽管已经在非生物胁迫条件下的模式和非模式植物中鉴定出许多MYB基因并对其进行功能分析，但关于建兰的MYB基因家族成员信息及其功能尚不清楚。基于此，本研究采用全基因组分析建兰的MYB系统发育系统、基序组成和重复序列，并采用qRT-PCR分析目标建兰MYB基因对不同盐胁迫类型的表达水平。研究结果有助于对兰花耐盐机制及MYB基因在兰科中的功能提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 植物材料与培养方法
试验于2020年6—10月在贵州民族大学园艺组培室中进行。建兰品种为逸红双娇，为2年生组培苗。供试盐胁迫分别为氯化钠（NaCl）、硫酸钠（Na2SO4）、碳酸氢钠（NaHCO3）、碳酸钠（Na2CO3），均购自默克化学试剂有限公司。
将2年生的建兰植株采用MS培养基进行继代培养，继代培养5周后，按照上述盐胁迫类型进行相应处理（150 mmol/L），对照（CK）为加入无菌水，之后转移至4 ℃环境，于盐胁迫处理后24 h取样，采用液氮速冻用于植株RNA提取。
1.2 建兰MYB基因家族的鉴定和系统发育分析
1.2.1 建兰MYB基因的鉴定 从Pfam下载建兰（C.ensifolium）的MYB DAN-binding结构域信息（PF002499，http：//pfam.sanger.ac.uk/），将其结构域信息保存为隐藏马尔可夫格式（HMM），并使用hmmer 3.0进行检索。从拟南芥信息资源库（https：//www.Arabidopsis.org/）下载拟南芥MYB蛋白序列对建兰的MYB基因组数据库进行Blast对比，参数设置值<10-20构建fasta文件（CeMYB.fasta）。随后采用NCBI的conserved Domains Tool工具对CeMYB.fasta进行筛选，以去除CeMYB结构域缺失或不正确的序列；按照Christian等所述的分类方法［19］对MYB进行分类，以得到CeMYB基因家族信息。
1.2.2 建兰MYB基因的序列分析及系统发育分析 对获得的CeMYB基因家族信息库分别进行分类分析，采用ExPASy系统（http：//web.expasy.org/compute_pi/）和WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）用于预测CeMYB蛋白的分子量、等电点及亚细胞位置等［20］。采用Clustal W生成多序列比对，通过在线工具WebLogo（http：//weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）确定MYB蛋白的DNA-binding结构域特征。
通过MUSCLE软件对建兰和拟南芥的MYB蛋白的全长蛋白质序列进行对比，将拟南芥的MYB和建兰MYB的比对蛋白序列提交到IQ-TREE v1.6.12系统采用邻接法构建MYBs的系统进化树。
1.2.3 建兰CeMYB基因结构和保守motif分析 基于基因结构显示服务器（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）网站分析该家族成员的外显子-内含子结构，采用MEME（http：//memesuite.org/tools/meme）设定基序（motif）数为2［21］，而其他参数保持默认，利用PSORTP rediction（https：//prosite.expasy.org/）进行亚细胞定位预测，结果采用TBtools软件进行可视化［22］。
1.2.4 建兰CeMYB基因启动子序列分析、染色体定位和同线性分析 通过PlantCARE预测顺式作用元件（http：//bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）基于CeMYB的启动子序列（起始密码子上游1 500 kb序列）。通过TBtools根据建兰基因组的注释数据获得CeMYBs在建兰基因组中的染色体定位。使用TBtools的One Step MCScanx程序显示每对建兰染色体之间的同线关系［23］，并采用TBtools进行可视化分析。
1.3 CeMYB基因响应不同盐胁迫类型的表达分析
1.3.1 建兰RNA提取 将建兰植株根系、假鳞茎、叶片及花序样品（250 mg）加入液氮快速研磨，按照Plant RNA Kit提取试剂盒（omega）相关说明提取建兰总RNA，采用Nano Drop 2000紫外分光光度计（Nano Drop 2000，USA）检测RNA浓度，采用2%琼脂糖凝胶电泳检测检验RNA质量。
1.3.2 建兰RT-qPCR分析 将质检合格的RNA采用反转录试剂盒Ⅱ（Evo M-MLV）反转录合成cDNA，将cDNA采用无菌水稀释100倍，作为后续RT-qPCR的模板。建兰相关引物采用Primer 6.0软件设计扩增引物（表1），以GAPDH作为内参基因。RT-qPCR反应体系与反应程序参照曹映辉等的方法［24］，使用Bio-Rad（Bio-Rad Laboratories Inc.，USA）的C1000 Touch PCR热循环仪和CFX Connect实时检测系统，每个处理进行3个复孔，采用2-ΔΔCT [KG*5]法计算基因的相对表达量。
1.4 数据处理与统计分析
采用Excel 2007对CeMYB的qRT-PCR数据进行整理，采用DPS 14.0进行方差分析及Duncans檢验，相关图形采用R5、Origin 2022绘制。
2 结果与分析
2.1 建兰MYB转录因子的筛选
由图1可知，将建兰转录组相关蛋白序列注释至PlantTFDB数据库，通过BLAST对比最终鉴定出10种共678个转录因子。其中，MYB转录因子家族的数量最多，达143个，其次为bZIP、bHLH、C3H型转录因子，分别为99、86、69个。随后以拟南芥的MYB蛋白全序列为对比库，通过BLAST对比初步鉴定，然后通过Pfam筛选出来，在建兰基因组中共获得140个MYB序列，使用hmmer 3.0检索，共获得136条完整的MYB序列，其中包括27个1R-MYB、102个R2R3-MYB、5个3R-MYB和2个4R-MYB，根据其在染色体上的位置命名为CeMYB1～CeMYB136。
2.2 建兰MYB基因家族的系统发育和分类
由图2可知，对136个建兰MYB转录因子蛋白序列信息和131个拟南芥（A.thaliana）MYB进行多序列对比，根据对比结果构建系统发育树。结果表明，建兰和拟南芥的MYB成员可形成25个亚家族，分别命名为S1～S25。这些亚家族还包含一些最初不属于S25亚家族的R2R3-MYB成员，并且大多数亚群包含来自建兰和拟南芥的R2R3-MYB成员，表明一些R2R3-MYB同源成员可能在漫长的进化历程中发生了丢失，就建兰MYB家族成员而言，参照拟南芥MYB的基本表征可将建兰MYBs分为20个亚家族，其中，S21亚家族拥有最多的MYB成员（16个），其次是S14亚家族（10个），而S7、S9、S16和S19的CeMYB数量最少，各含2个。
2.3 建兰MYB蛋白保守基序分析
2.3.1 建兰MYB蛋白保守基序分布分析 为研究CeMYB蛋白序列的功能多样化形式，通过MEME系统鉴定了CeMYB转录因子的15个保守基序（基序1～15）。由图3-A可知，大多数基序集中、规则分布在CeMYBs的N端，少数基序不规则分布在C端；属于同一亚科的CeMYB整体具有较为相似的保守基序，而不同亚科的CeMYB之间基序存在较大差异。大多数CeMYB具有基序1、2、3、5，几乎所有CeMYB都包含2个以上的保守基序，而CeMYB131、CeMYB38和CeMYB40仅含有1个基序；CeMYB99、CeMYB83和CeMYB129包含基序1和基序5。除了CeMYB86、CeMYB39含有基序10和基序12外，仅S1亚家族的成员有基序10、基序12。此外，基序13仅存在于S21亚家族成员的C端，推测保守的基序可能与该亚科的特定功能有关。由图 3-C 可知，CeMYB82、CeMYB15、CeMYB13、CeMYB14、CeMYB40、CeMYB39、CeMYB8、CeMYB53、CeMYB76、CeMYB75、CeMYB62、CeMYB3、CeMYB59、CeMYB115和CeMYB25无内含子，而其他CeMYB有1～13个内含子。共有66个CeMYB含有2个内含子和3个外显子，其占CeMYB总数的49.3%。这些结果表明，虽然一部分CeMYB的基因结构高度保守，但不同亚科的CeMYBs仍表现出较为复杂的序列多样性。
2.3.2 建兰MYB蛋白保守结构域基序分析 将136个CeMYB序列信息上传到WebLogo以检查该家族成员是否含有共同的保守序列。由图4可知，CeMYBs的R2和R3结构域相对保守，在每18个氨基酸中鉴定出约1个色氨酸残基。R2结构域包括3个色氨酸残基（W），而R3结构域中的第1个色氨酸残基被苯丙氨酸残基（F）替换；因此，仅有1个色氨酸残基存在于R3域中。
2.4 建兰MYB的染色体定位和共线性分析
2.4.1 建兰MYB转录因子的染色体定位 由染色体作图结果（图5）可知，在136个CeMYB中有134个CeMYB不均匀分布在建兰的18号染色体上，2个CeMYBs定位于未具体分类的支架上。3号染色体具有最多的CeMYB（18个），7号染色体有11个CeMYB，1、2、4号染色体分别有10个CeMYB，其他染色體具有1～9个CeMYB。 此外 蛋白质亚细胞定位结果表明，大多数CeMYB定位于细胞核中。
2.4.2 建兰MYB转录因子分布的共线性分析 由图6可知，串联重复和片段重复都有利于植物基因家族的扩增，共线性分析表明，建兰MYB基因组包含29对片段复制的基因。在12号染色体上具有最多的片段重复基因，在11、13、14、18、20号染色体上分别仅发现了1个重复基因。此外，还鉴定出23对串联重复的基因对，其中，大部分出现在3号染色体上。在串联重复的基因中，CeMYB13和CeMYB15、CeMYB75和CeMYB76、CeMYB96和CeMYB97、CeMYB113和CeMYB114、CeMYB105和CeMYB106、CeMYB87和CeMYB88均两两位于染色体的相同位置，且均具有较为相似的保守基序和基因结构。
2.5 建兰MYB在不同组织中的表达模式分析
由图7可知，从转录组数据中获得不同组织中108个CeMYB的表达水平（有28个CeMYB在建兰叶片中不表达，因此未展示）并绘制Heatmap图，将这些基因分为7组（A～G）。在108个CeMYB中，A组有18个基因在花序（flower）和叶片（leaf）中低表达，在根系（root）和假鳞茎（stem）中高表达。此外，由图8-A可知，A组基因的表达模式与建兰植株Na+浓度趋于一致 表明A组基因可能参与了植株的盐胁迫调控。B组共14个基因仅8个基因在根系中表达，而在其他组织中不表达或表达水平水平较低。C组共9个基因在花序和根系中的表达水平较高。D组的22个基因中，CeMYB78、CeMYB84、CeMYB132在叶片和花序中高表达，CeMYB130、CeMYB107、CeMYB70、CeMYB119基因在根系和叶片中高表达。E组13个基因仅在花序中高表达。F组中全部基因（15个）在假鳞茎均具有较高的表达水平。G组中，除CeMYB94、CeMYB33、CeMYB71基因外，其他基因均在叶片中高表达，部分基因（CeMYB94、CeMYB33、CeMYB98、CeMYB47）也在假鳞茎中高表达。值得注意的是，A组CeMYB89和CeMYB61在根系、假鳞茎、叶片及花序中均具有较高的表达水平，且均属于S13亚家族，初步表明该两者基因参与盐胁迫的调控，应在后续研究中予以重视。
2.6 qRT-PCR分析靶向CeMYB在不同盐胁迫类型下的验证
由图8可知，选择参与盐胁迫调控的S13亚科CeMYB89和CeMYB61，研究其在不同盐胁迫中的表达水平，在CeMYB61、CeMYB89中，任一组织器官中CK表达水平皆较低，盐（NaCl、Na2SO4、Na2CO3、NaHCO3）胁迫处理均显著或极显著大于CK，且盐胁迫处理间均表现为NaCl
3 讨论与结论
全基因组分析是探索植物中MYB家族生物学功能的重要方法［25-26］。本研究基于建兰基因组鉴定出136个CeMYB转录因子，其中102个CeMYB隶属于R2R3-MYB亚家族，占比75%；其结果与前人研究基本一致，即在兰科植物中R2R3-MYB是最大的MYB亚家族，其占比高达70%以上［27］；而与小麦［28］、烟草［11］等其他物种存在较大差距，数量差异的原因可能是由基因组大小和基因重复元件造成的［7］，这也反映了植物R2R3-MYB转录因子在进化过程中的复杂性和多样性。
通过结合来自拟南芥的MYB蛋白的系统发育分析，根据MYB的保守性和相同功能将相关基因被归入同一亚组，CeMYB可划分为20个亚科。CeMYB61和CeMYB89归属于S13亚科中与AtMYB86、AtMYB50和AtMYB61聚为一类，AtMYB86、AtMYB50在以往的研究中已被证实参与拟南芥盐胁迫调控［16］，初步显示表明，CeMYB61、CeMYB89可能参与建兰对盐胁迫的调控。此外，部分建兰CeMYB成员与拟南芥AtMYB的生物学特征不同，这表明这些基因可能是拟南芥分化后形成的，其可能具有独特的生物学功能，或者这些基因可能在进化过程中从拟南芥基因组中丢失［29］。基因复制在植物进化中发挥着重要作用，是基因家族扩展的主要机制。前人研究表明，在拟南芥中发生了3起全基因组复制（WGD）事件［30］，而在兰科植物中则发生了2次［2］。本研究中，建兰基因组中有23对串联重复的CeMYB和29对分段重复的CeMYB，基因串联重复事件在染色体上均匀出现，这些结果表明基因重复是介导MYB基因家族进化的重要事件。
建兰MYB蛋白保守结构域基序分析表明，CeMYB的结构域包含有代表性的色氨酸残基，其中R2具有3个高度保守的色氨酸残基，而R3中的第1个色氨酸残基被苯丙氨酸取代。这一结果与在矮牵牛（Petunia hybrida Vilm）中观察到的结果一致［31］，每个R基序中的色氨酸残基有助于维持螺旋-转螺旋（HTH）结构，使MYB转录因子能够与DNA结合［32］；R3中色氨酸残基被取代可能有助于识别新的靶基因，也可能导致DNA与靶基因的结合活性丧失［29］。此外，建兰MYB蛋白保守基序分布分析表明，系统发育树中密切相关的CeMYB具有相似的保守基序，大多数CeMYB包含基序1、2、3、5。且大多数CeMYB（49.3%）包含2个内含子和3个外显子，仅有S1亚家族的成员具有基序13，这意味着S1中的CeMYB可能具有不同于其他亚群的特殊功能。总体而言，同一进化分支中的基序、內含子和外显子的数量较为相似，仅少数CeMYB发现了变异。
本研究中，建兰MYB的转录组分析表明，不同组织中仅S13亚科中CeMYB61、CeMYB89的表达模式与建兰组织中的Na+浓度分布趋势一致，再次表明该两者基因可能参与建兰耐受盐胁迫的调控。qRT-PCR结果表明，CeMYB61、CeMYB89在不同组织中表现为根系>假鳞茎>叶片>花序，其表达水平、模式与组织中的Na+浓度一致，证实了CeMYB61、CeMYB89是建兰耐受盐胁迫的指示基因。此外，就转录丰度来看，在任一组织器官中，CeMYB61、CeMYB89均表现为从最大至最小列为NaCl 综上，本研究从建兰基因组中共鉴定出136个CeMYB转录因子，通过与拟南芥MYB进行系统发育得到20个基因簇，根据TBtools进行染色体定位显示，136个CeMYB均匀分布在18条染色体上。保守域分析表明，它们具有典型的氨基酸序列重复，基序预测显示，多个保守元件主要位于CeMYB的N端，表明它们的功能相对保守，大多数CeMYB位于细胞核中；基于CeMYB的转录组表达分析表明，S13亚科的CeMYB61和CeMYB89可能是调控盐胁迫的关键基因，qRT-PCR验证显示CeMYB61、CeMYB89表达水平、模式与各组织中的Na+浓度分布一致，证实了CeMYB61、CeMYB89是建兰耐受盐胁迫的指示基因。 参考文献： ［1］陈明堃，陈 璐，孙维红，等. 建兰种质资源遗传多样性分析及核心种质构建［J］. 园艺学报，2022，49（1）：175-186. ［2］Ai Y，Li Z，Sun W H，et al. The Cymbidium genome reveals the evolution of unique morphological traits［J］. Horticulture Research，2021，8：255. ［3］Li J W，Chen X D，Hu X Y，et al. Comparative physiological and proteomic analyses reveal different adaptive strategies by Cymbidium sinense and C.tracyanum to drought［J］. 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