基于SSR标记的西南地区野生带叶兜兰资源遗传多样性分析

徐 言，陈之光，徐玉凤，葛 红，杨树华，赵 鑫，寇亚平，于晓南，贾瑞冬*

基于SSR标记的西南地区野生带叶兜兰资源遗传多样性分析

徐 言1,2，陈之光2，徐玉凤2，葛 红2，杨树华2，赵 鑫2，寇亚平2，于晓南1*，贾瑞冬2*

1. 北京林业大学园林学院/花卉种质创新与分子育种北京市重点实验室/国家花卉工程技术研究中心/城乡生态环境北京市实验室，北京 100083；2. 中国农业科学院蔬菜花卉研究所/农业农村部花卉生物学与种质创制重点实验室（北方），北京 100081

带叶兜兰[(Lindl. ex Hook. f.) Stein]具有较高的观赏价值，是中国珍稀濒危保护植物。为了研究中国西南地区野生带叶兜兰资源的遗传特性，促进野生带叶兜兰资源的保护和利用，本研究利用SSR分子标记技术对中国西南地区广西、云南、贵州3省（区）收集的6个居群190份带叶兜兰资源进行遗传多样性和群体遗传结构分析。结果表明：从115对引物中共筛选出10对扩增效果好的引物，10对SSR引物在190份带叶兜兰中共检测到50个等位基因，平均每个位点等位基因（N）为5个，平均有效等位基因数（N）为2.4835个；平均Shannon信息指数（）为0.8592，平均观测杂合度（H）为0.4518；平均期望杂合度（H）为0.4387，平均Nei’s基因多样性指数（）为0.4370，平均多态信息含量（PIC）为0.3996。6个野生带叶兜兰居群的N为2.8000～4.3000，N为1.9655～2.4060， H为0.3891～0.4839，H为0.3795～0.4683，Shannon信息指数（）为0.6584～0.8369，Nei’s基因多样性指数（）为0.3648～0.4382。广西雅长（GYC）和贵州万峰湖（QWF）居群具有较高的遗传多样性（=0.4382,=0.4276），广西木论（GML）居群具有最低的遗传多样性（=0.3648）。分子方差分析（AMOVA）结果表明，遗传变异主要发生在居群内个体间（94%），而居群内遗传分化很小（6%）。基于遗传距离构建的UPGMA聚类分析结果显示，6个居群遗传距离较小，居群间遗传距离和地理位置不完全相关。Structure和主坐标分析结果表明，居群间存在均质化现象，无明显类群划分。综上，带叶兜兰资源遗传多样性较为丰富，研究结果可为中国西南地区野生带叶兜兰资源的保护和利用提供理论依据。

带叶兜兰；野生居群；SSR标记；遗传多样性；遗传结构

带叶兜兰[(Lindl. ex Hook. f.) Stein]为兰科（Orchidaceae），杓兰亚科（Subfam. Cypripedioideae）兜兰属（Pfitz.）植物，自然花期3—5月，主要分布于中国、印度东北部、越南、老挝和泰国，其中在中国分布于广西北部至西部、贵州西南部、云南东南部等地[1]。由于生境破坏、过度采集和非法贸易等情况严重，使带叶兜兰野生资源遭受严重的威胁。目前带叶兜兰野生种已被列入《野生动植物濒危物种国际贸易公约》（CITES）附录Ⅰ的保护范围，绝对禁止在国际上贸易[2-4]。它还被收录于《中国高等植物红色名录》，评估等级为易危（VU），且有野生带叶兜兰居群呈现破碎化现象的报道[5-6]。此外带叶兜兰是一个变异幅度很大的种，在花的结构上有很多变化[1]。因此，利用分子技术对带叶兜兰野生资源及其遗传状况进行研究具有重要的意义。

分子标记技术在兰科植物研究中已被广泛使用。在兜兰属植物研究中，有基于ITS序列[7-8]、RAPD[9]和SRAP[10]标记的种间亲缘关系及其分类归属研究，有基于cpDNA[11]分子标记的系统进化研究，有基于转录组数据开发SSR引物[12-13]的研究，以及基于SRAP[14-16]、ISSR[16-18]和SSR[12]标记的遗传多样性研究，其中关于带叶兜兰的研究报道较少，仅见基于SRAP标记对广西木论自然保护区的40份野生带叶兜兰资源[14]和基于SSR标记对广西雅长自然保护区的32份野生带叶兜兰资源进行遗传多样性研究的报道[12]。中国西南地区的云南、贵州和广西3个省（区）均为中国带叶兜兰的主要分布地区，而只有以上2篇研究广西地区带叶兜兰单居群遗传多样性的文献，涉及的采集样本均有一定的地域局限性，且未涵盖多居群和群体结构研究，不足以反映中国带叶兜兰资源的遗传水平。

SSR简单重复序列（SSR）又称为微卫星（microsatellites）或者串联重复序列（STR），由1～6个碱基为重复单位组成的短串联重复序列，它广泛、丰富且随机地分布于真核生物基因组中[19]。SSR标记具有数量多、分布广、多态性高、重复性好、共显性和易检测等特点，已经成为研究种群遗传多样性和遗传结构的最有效分子标记之一[20]。

本研究以云南、贵州和广西的6个野生带叶兜兰居群为研究材料，在已发表的带叶兜兰表型多样性研究的基础上[21]，利用SSR标记技术对其进行遗传多样性分析和群体结构分析，并综合分析表型数据和分子数据，以期为中国西南地区野生带叶兜兰的资源保护工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

根据网上搜索、相关文献记载和实地踏查情况，采集来源于带叶兜兰天然分布区内广西、云南和贵州3省（区）的6个野生居群，共计190份样品，具体采样信息见表1和图1。其中在广西木论（GML）和云南柳井（YDZ）居群带叶兜兰分布范围较窄，数量较少，因此采集到的样本数量也相对较少。采样标准为居群间的地理距离大于10 km，株间距大于10 m，且无病虫害。每个单株采集新鲜叶片放入装有变色硅胶的塑料自封袋中，干燥备用。

表1 6个居群的采样信息

图1 样品采集点分布图

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 基因组DNA的提取参照本实验室改良后的亨利兜兰基因组CTAB提取方法进行[22]。获取的基因组DNA用1%琼脂糖凝胶电泳检测纯度和完整性，并用Nanodrop 2000微量分光光度计（Thermo，美国）检测浓度和质量，将合格的DNA样品保存于‒20 ℃，备用。

1.2.2 SSR引物筛选 参考本实验室基于亨利兜兰转录组数据开发的引物[22]，从115对引物中共筛选出10对扩增效果好的SSR引物（表2）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司北京分公司合成。

表2 10对SSR引物信息

1.2.3 PCR扩增及测序 在C1000 Touch实时定量PCR仪（Bio-Rad，美国）上进行反应，PCR反应体系（20 μL）：10×buffer 2.0 μL，dNTPs 1.5 μL，上、下游引物各2.0 μL，Ex0.2 μL，DNA 3.0 μL，ddH2O 9.3 μL。PCR扩增反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循环10次；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循环15次；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循环10次；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR产物使用2%琼脂糖凝胶电泳检测，合格后送至上海天昊生物公司进行基于二代测序技术的SSR基因分型。

1.3 数据处理

采用Excel 2010软件统计并整理SSR基因分型数据。利用Genalex 6.501[23]和PopGene 1.32[24]软件计算多态性位点比率（PPB）、等位基因数（N）、有效等位基因数（N）、Shannon信息指数（）、观测杂合度（H）、期望杂合度（H）、Nei’s基因多样性指数（）、Nei’s遗传距离（G）、遗传相似性（G）和基因流（N）等。利用PIC-Calc软件计算多态信息含量（PIC）。利用Genalex 6.501[23]软件进行基于遗传距离的主成分分析（PCoA）和分子方差分析（AMOVA）。利用Mega 7.0[25]软件的非加权平均法（UPGMA）进行聚类分析，并构建基于遗传距离的聚类图。利用Structure 2.3.4[26]软件进行遗传结构分析，设置值为1～10，对不同的值进行10次重复运算。使用马尔可夫链法（Markov’s Chain Monte Carlo, MCMC），设burn-in为100 000次，run-length为100 000次迭代，之后用在线软件Structure harvester（http://taylor0.biology.ucla.edu/structure harvester/）根据∆峰值位置来确定最佳分组群，并绘制群体结构分析图。

2 结果与分析

2.1 SSR标记多态性

利用10对SSR引物对190份带叶兜兰材料进行SSR多态性分析（表3）。由表3可知，共检测到50个N，N在2～9之间，平均每个SSR标记5个等位基因。N为1.0269～ 6.7468，平均值为2.4835。在0.0843～2.0272之间，平均值为0.8592。H在0.0265～0.8677之间，平均值为0.4518。H在0.0263～0.8540之间，平均值为0.4387。在0.0262～0.8518之间，平均值为0.4370。PIC在0.0260～0.8346之间，平均值为0.3996。参照BOTSTEIN等[27]提出的衡量基因变异程度高低的PIC指标，有4个位点（DY383、DY687、DY716、DY800）是高度多态性位点（PIC>0.50），4个位点（DY356、DY376、DY413、DY669）是中度多态性位点（0.25

表3 10对SSR引物的多态性分析

2.2 居群遗传多样性

带叶兜兰各野生居群遗传多样性检测结果见表4。6个居群的多态性位点比率（PPB）在70%～100%之间，平均值为88.33%。N在2.8000～ 4.3000之间，平均值为3.3833。N为1.9655～2.4060，平均值为2.1901。在0.6584～0.8369之间，平均值为0.7425。H在0.3891～0.4839之间，平均值为0.4465。H在0.3795～0.4683之间，平均值为0.4205。在0.3648～0.4382之间，平均值为0.4008。表明6个带叶兜兰居群的遗传多样性丰富，其中广西木论（GML）遗传多样性最低，广西雅长（GYC）和贵州万峰湖（QWF）遗传多样性较高。

表4 基于10对SSR引物的带叶兜兰6个居群的遗传多样性

2.3 居群遗传分化

带叶兜兰居群的分子方差分析（AMOVA）结果表明，带叶兜兰居群间的遗传变异仅有6%，而居群内的遗传变异有94%，绝大部分遗传变异发生在各居群的内部（表5）。说明野生带叶兜兰资源的遗传多样性以居群内的变异为主，居群内分化程度较高，而居群间遗传分化较小。

2.4 聚类和主坐标分析

遗传距离和遗传相似性是衡量居群亲缘关系的重要指标，6个居群间的Nei’s遗传距离（G）和遗传相似性（G）见表6。6个居群间G在0.0169～0.1330之间，G在0.8755～0.9832之间。其中GML和YDZ居群间的G最大（0.1330），GYC和QWF居群间的G最小（0.0169）。GYC和QWF居群间的G最大（0.9832），GML和YDZ居群间的G最小（0.8755）。

根据居群间的Nei’s遗传距离采用UPGMA法进行聚类分析（图2），结果显示，广西雅长（GYC）和贵州万峰湖（QWF）首先聚为一支，再依次和贵州桔山（QJS）、云南法斗（YFD）、云南柳井（YDZ）聚集，最后和广西木论（GML）聚集。结果表明居群间遗传距离与地理距离无显著相关性。

表6 带叶兜兰居群间的遗传距离（Gd）和遗传相似性（Gi）

注：对角线下方为Nei’s遗传距离（G），对角线上方为Nei’s遗传相似性（G）。

Note: Below diagonal is Nei’s genetic distance (G), and above diagonal is Nei’s genetic identity (G).

图2 基于Nei’s遗传距离的带叶兜兰居群的聚类图

为进一步研究群体间的遗传关系，对190份带叶兜兰进行主坐标分析（PCoA）。其中第一主成分和第二主成分分别可以解释总变量的31.63%和10.07%（图3）。主坐标结果表明带叶兜兰居群间均质化明显，居群内存在着种质混杂现象。

2.5 居群遗传结构

利用Structure的贝叶斯聚类方法对6个带叶兜兰居群进行遗传结构分析，根据EVANNO等[28]的方法用最大似然值∆来确定值。Structure分析结果显示在1～10之间，为2时，∆取得最大值（图4），表明6个居群190个个体的基因型分为2种。2种基因型在每个居群中分布比例相似，不能按照不同基因池区分（图5），表明带叶兜兰居群间均质化，可能由于较高基因流导致。

图3 基于Nei’s遗传距离的主坐标分析图

图4 ∆K分布图

图5 带叶兜兰居群Structure聚类结果（K=2）

3 讨论

3.1 带叶兜兰居群的遗传多样性

遗传多样性是体现一个物种进化潜力和抵抗外界环境变化的能力，遗传多样性水平越高，物种适应环境变化的能力越强，反之越弱[29]。本研究所选的6个居群是本实验室从2013年开始，通过查阅文献、网上搜索和多年实地踏查所收集到的所有居群，其中贵州万峰湖（QWF）、贵州桔山（QJS）、云南法斗（YFD）和云南柳井（YDZ）这4个居群均是首次对其进行研究报道。

本研究对6个带叶兜兰居群的SSR检测结果表明，在物种水平（=0.8592,=0.4370）和居群水平（PPB=83.33%,=0.7425,=0.4008）上均具有丰富的遗传多样性。与以往的兜兰属植物遗传多样性研究相比，高于朱亚艳等[10]利用SRAP标记分析的8种兜兰的遗传多样性（PPB=80.26%,=0.4241,=0.2879），略高于李宗艳等[17]利用ISSR标记分析的7个硬叶兜兰居群的遗传多样性（PPB= 96.04%,=0.4889,=0.3244），略高于HUANG等[16]利用ISSR和SRAP标记分析的15个硬叶兜兰居群的遗传多样性（ISSR: PPB=80.28%,=0.4236; SRAP: PPB=70.67%,=0.3301），也高于秦惠珍等[18]利用ISSR标记分析的8个白花兜兰居群的遗传多样性（PPB=78.33%,=0.4191,= 0.2808）。高丽霞等[14]利用SRAP标记分析的广西木论自然保护区的40份野生带叶兜兰的遗传多样性（PPB=24.22%,=0.1582,=0.1282）低于本研究中同位于广西木论县木论自然保护区的广西木论（GML）的遗传多样性（PPB=70%,=0.6584,=0.3648），推测可能与本研究采用的SSR标记具有更高的多态性和保护区的保护有关。CHEN等[12]利用SSR标记分析的广西雅长自然保护区的32份野生带叶兜兰的遗传多样性（N=2.9300,N=2.2200,H= 0.5313）略高于本研究中同位于广西雅长自然保护区的广西雅长（GYC）的遗传多样性（N= 3.9000,N=2.2820,H=0.4452）。本研究对6个带叶兜兰居群的研究也显示了广西木论（GML）的遗传多样性最低，广西雅长（GYC）的遗传多样性较高，推测可能和位于雅长自然保护区的带叶兜兰居群较大，而位于木论自然保护区的居群较小有关。本研究与上述近缘或相同物种的多项指标比较表明，带叶兜兰整体遗传多样性丰富，高于硬叶兜兰和白花兜兰。

3.2 带叶兜兰居群的遗传结构

遗传分化是反映遗传结构的重要指标。本研究通过AMOVA分析显示，94%的遗传分化发生在居群内，居群间遗传分化很小（6%），即带叶兜兰主要遗传变化来自居群内的个体间变异。李宗艳等[17]利用ISSR标记对7个硬叶兜兰居群进行AMOVA分析显示，硬叶兜兰居群内（60.4%）的遗传变异大于居群间（39.60%）。HUANG等[16]利用ISSR和SRAP标记对15个硬叶兜兰居群进行AMOVA分析，ISSR标记结果显示硬叶兜兰居群内（69%）遗传变异大于居群间（31%），SRAP标记结果也显示硬叶兜兰居群内（75%）遗传变异大于居群间（25%）。秦惠珍等[18]利用ISSR分子标记对8个白花兜兰居群进行AMOVA分析显示白花兜兰居群内（87.53%）遗传变异大于居群间（12.47%）。多项指标表明多数兜兰属植物的遗传变异均以居群内的遗传变异为主。这一结果可能与兜兰具有欺骗性授粉的特征有关，欺骗性授粉的物种比向传粉者提供回报的物种具有更高的基因流动，且兜兰种子细小也有利于远距离传播[11]。此外，评价居群的遗传结构需要结合物种的繁育系统和传粉方式等因素进行综合分析，目前尚无带叶兜兰繁育和传粉的相关报道，后续应加强对这方面的研究来进一步阐明其遗传结构的形成原因。

遗传结构是评价遗传资源的关键。本研究通过UPGMA聚类、PCoA分析和Structure群体结构分析对带叶兜兰资源进行划分，3种分析方法得到的结果相似，均显示6个野生带叶兜兰居群无明显的类群划分，居群间存在基因渐渗的现象且均质化明显。这可能会降低物种的长期适应性进化能力，增加在不断变迁的环境中因随机事件而灭绝的风险。推测很可能因为现存的各个居群起源于相同的祖先居群，由于在历史中发生生境片段化，造成这一连续分布的祖先居群残留成目前多个分散的居群。

3.3 表型多样性和遗传多样性关联分析

本研究与本实验室王文晓等[21]的带叶兜兰表型多样性分析结果相比，其中有5个居群采样地点均与王文晓等文中相对应（王文晓等文中的YDZ居群采样地由云南省马关县斗嘴乡更正为云南省文山县柳井彝族乡斗咀村，居群字母简称YDZ不变）。王文晓等根据18个表型性状变异系数分析显示，5个野生居群内变异系数由高到底为云南法斗（YFD）＞贵州万峰湖（QWF）＞广西雅长（GYC）＞云南柳井（YDZ）＞广西木论（GML），本研究根据遗传多样性分析结果显示，6个野生居群遗传多样性由高到低为广西雅长（GYC）＞贵州万峰湖（QWF）＞云南法斗（YFD）＞贵州桔山（QJS）＞云南柳井（YDZ）＞广西木论（GML），二者结果部分相似；但王文晓等根据巢氏方差分析表型分化系数显示，居群间的表型分化大于居群内，而本研究根据AMOVA分析遗传分化系数显示，居群内的遗传分化远远大于居群间；聚类结果也不同，王文晓等按照表型性状Q型聚类将居群划分为3类，云南法斗（YFD）和云南柳井（YDZ）为一类群，广西雅长（GYC）和广西木论（GML）为一类群，贵州万峰湖（QWF）为一类群，其结果大致同地理位置及生境相符。这种利用表型性状检测植物遗传变异和多样性的方法简便易行，能够短期内基本了解植物的遗传变异水平[30]。但植物形态学特征受环境影响较大，在不同生境下营养和生殖性状均会出现差异，因此存在一定的局限性[31]。而利用SSR分子标记技术是从DNA水平上反映个体间的遗传变异现象，不受生长发育和时间的制约，避免环境干扰，成本低，检测效率高，能更准确地反映类群间的亲缘关系[32]。基于SSR技术，本研究聚类结果表明，不同居群的带叶兜兰的遗传结构未严格按照地理距离划分，这一结果与本实验室硬叶兜兰13个居群遗传多样性分析结果类似，广西木论（GML）居群和其他居群遗传距离最远（数据尚未发表）。其原因可能是：（1）由于贵州万峰湖（QWF）居群位于5个居群的中间位置，与其他居群有相对较大的基因流交流，基因重组的空间和机会更大，更容易扩大种群的遗传多样性水平；（2）贵州万峰湖（QWF）和广西雅长（GYC）居群分别位于红水河水系的上下游，通过红水河水系增加了这2个居群间的基因交流，因此这2个居群间关系最近。

3.4 带叶兜兰资源保护

遗传多样性是种质资源保护与评价的重要指标[33]。通过对中国西南地区的6个带叶兜兰居群的遗传多样性进行研究，结果表明带叶兜兰具有相对丰富的遗传多样性，但居群间存在均质化现象。在6个居群中，贵州万峰湖（QWF）居群和位于广西雅长自然保护区的广西雅长（GYC）居群遗传多样性较高，应作为核心种群重点保护，可见选择在广西雅长作为全国唯一一个国家级兰科植物自然保护区，在带叶兜兰的保护上其意义重大。由于带叶兜兰居群内个体间的遗传变异较高，因此也要加强对居群内部每个个体的保护，以保持最大遗传变异基因库为目标。

此外，通过全基因组重测序和简化基因组测序等高通量测序技术开发分子标记，已广泛应用于大田作物和蔬菜中，这也给兰科植物起源和进化带来新的研究方向[34]。如简化基因组测序技术有不参考基因组就可以进行大量SNPs开发的优势，目前在兰科植物中石斛属[35]、蝴蝶兰属[36]上已有应用，但尚无新型分子标记技术应用于兜兰属植物的报道。为了更好地保护兜兰属植物，今后可以利用新型高通量测序技术开发新的标记技术，加强与邻国的交流，增加越南、老挝、印度、泰国等国家野生居群采样，以全面了解带叶兜兰资源的遗传状况。

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Genetic Diversity of WildPopulations in Southwest China with SSR Markers

XU Yan1,2, CHEN Zhiguang2, XU Yufeng2, GE Hong2, YANG Shuhua2, ZHAO Xin2, KOU Yaping2, YU Xiaonan1*, JIA Ruidong2*

1. College of Landscape Architecture, Beijing Forestry University / Beijing Key Laboratory of Ornamental Plants Germplasm Innovation & Molecular Breeding / National Engineering Research Center for Floriculture / Beijing Laboratory of Urban and Rural Ecological Environment, Beijing 100083, China; 2. Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Flower Crops (North China), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100081, China

(Lindl. ex Hook. f.) Stein is a rare and endangered plant in China with high ornamental value.In order to explore the genetic characteristics of wildresources in Southwest China, and contribute to the protection and utilization of the wild resources, this study used SSR molecular marker to analyze the genetic diversity and population genetic structure of 190resources which collected from six populations in Guangxi, Yunnan and Guizhou provinces in Southwest China. In this study, the results showed thatten pairs of primers with good amplification effect were selected from 115 pairs of primers, and 50 alleles were detected by 10 pairs of SSR primers of 190.The average number of alleles (N) was five and the average number of effective alleles (N) was 2.4835. The average Shannon information index () was 0.8592. The average observed heterozygosity (H) was 0.4518 and the average expected heterozygosity (H) was 0.4387. The average polymorphic information content (PIC) was 0.3996 and the average Nei’s expected heterozygosty () was 0.4370.In this six wildpopulations,the number of alleles (N) was from 2.8000 to 4.3000. The number of effective alleles (N) was from 1.9655 to 2.4060. The observed heterozygosity (H) was from 0.3891 to 0.4839. The expected heterozygosity (H) was from 0.3795 to 0.4683. The Shannon information index () was from 0.6584 to 0.8369, and the Nei’s expected heterozygosty () was from 0.3648 to 0.4382.In the six wild populations, the genetic diversity of Guangxi Yachang (GYC) and Guizhou Wanfeng Lake (QWF) populations was generally higher (=0.4382,=0.4276), while the genetic diversity of Guangxi Mulun (GML) population was relatively low (=0.3648).Analysis of molecular variance (AMOVA) results showed that genetic variation mainly occurred among individuals within the population (94%),while genetic differentiation within populations was very small (6%).UPGMA cluster analysis based on genetic distance showed that the genetic distance of the sixpopulations was very small, there was no obvious group division and the genetic distance was not completely related to the geographical location.The results of Structure and principal coordinate analysis were consistent with those of UPGMA cluster analysis. Structure and principal coordinate analysis results showed that there was homogenization among the populations, and there was no obvious group division. In summary, the genetic diversity ofresources is relatively rich, which can provide a theoretical basis for the protection and utilization of wildresources in Southwest China.

; wild populations; SSR; genetic diversity; genetic structure

S682.31

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2023.11.009

2022-12-20；

2023-01-31

国家重点研发计划项目（No. 2021YFD1200200）。

徐 言（1998—），女，硕士研究生，研究方向：兰花种质资源与遗传育种。*通信作者（Corresponding author）：于晓南（YU Xiaonan），E-mail：yuxiaonan626@126.com；贾瑞冬（JIA Ruidong），E-mail：jiaruidong@caas.cn。