山核桃干腐病菌对甲基硫菌灵等4 种杀菌剂的抗性

施心成, 李 涛, 张传清

(浙江农林大学 现代农学院，杭州 311300)

我国现有山核桃Carya cathayensis栽培面积约为1.3 × 106hm2，产值超过35 亿元，其中浙江山核桃是天目山区经济林主栽品种，具有丰富的营养价值和极高的经济价值[1-2]。山核桃干腐病又称溃疡病，病原菌为球壳孢目的茶藨子葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea，危害较轻时影响树体生长，造成落果和减产；危害严重时导致山核桃树濒临枯死，造成严重损失[2-3]。近年来干腐病在山核桃主栽培区如浙江临安、桐庐、淳安及安徽绩溪、宁国等地普遍发生，其中临安区发生面积达2.67 万hm2，发病率高达80%，造成严重的经济损失[4]。

目前，生产中主要利用化学药剂防治山核桃干腐病[1,5]。常用药剂有甲基硫菌灵、戊唑醇、咪鲜胺和苯醚甲环唑等[6]。其中，甲基硫菌灵属于苯并咪唑类 (benzimidazoles, BENs) 杀菌剂，此类杀菌剂通过与构成真菌微管的β微管蛋白结合，阻碍其与另一组分α微管蛋白装配成微管，破坏纺锤体形成，干扰细胞分裂，从而阻碍真菌繁殖[7]。戊唑醇、咪鲜胺和苯醚甲环唑都属于甾醇脱甲基化抑制剂类 (sterol demethylation inhibitors, DMIs)杀菌剂，通过抑制真菌甾醇生物合成中C-14α脱甲基化反应，使真菌麦角甾醇的生物合成受阻，从而干扰细胞膜结构的形成[8]。这两类化合物都属于单作用位点的专化性杀菌剂，已在多种植物病原菌上出现抗药性问题[9]。甲基硫菌灵、戊唑醇、咪鲜胺和苯醚甲环唑4 种杀菌剂已用于防治山核桃干腐病多年，为了明确该病菌对上述杀菌剂的敏感性现状，本研究采用区分剂量法测定了山核桃干腐病菌对4 种杀菌剂的敏感性，评价了甲基硫菌灵抗性菌株的适合度并初步分析了其抗性分子机制，旨在为实际生产中科学应用杀菌剂防治山核桃干腐病提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

96 株山核桃干腐病菌Botryosphaeria dothidea，由浙江农林大学杀菌剂生物学与植物病害防治实验室于2016—2018 年自浙江省杭州市临安区和淳安县等地山核桃各主产区采集分离、鉴定并保存[10-11]。

1.2 供试杀菌剂

97%甲基硫菌灵 (thiophanate-methyl) 原药由浙江禾本农药化学有限公司提供，97% 戊唑醇(tebuconazole) 原药由江苏剑牌农化股份有限公司提供，97%咪鲜胺 (prochloraz) 原药由安道麦辉丰公司提供，95.1%苯醚甲环唑 (difenoconazole) 原药由浙江天一生物科技有限公司提供。甲基硫菌灵用二甲亚砜配制成质量浓度为1 × 105μg/mL 的母液，戊唑醇、咪鲜胺和苯醚甲环唑用丙酮配制成1 × 105μg/mL 的母液，于4 ℃保存，备用。

1.3 供试培养基

PDA 培养基：马铃薯200 g、琼脂20 g、葡萄糖20 g，无菌水定容至1 L。

1.4 抗药性频率检测

采用区分剂量法测定[12-14]。将病原菌分别在PDA 平板上活化培养3 d 后，用灭菌枪头沿菌落边缘打取直径5.0 mm 的菌饼，将带菌丝面朝下分别接种于含5 μg/mL 甲基硫菌灵、戊唑醇、咪鲜胺、苯醚甲环唑的PDA 平板中央，以不含药剂但含有相同浓度溶剂的处理作为对照 (CK)，每处理重复3 次。于25 ℃黑暗条件下培养3 d 后观察，将在含5 μg/mL 药剂平板上不能生长的视为敏感菌株，能够生长的视为抗性菌株[12-13]。按公式 (1)计算抗性频率 (R/%)。

式中，N1：抗药性菌株数，N：菌株总数。

1.5 有效抑制中浓度 (EC50) 测定

采用菌丝生长速率法测定[14]。随机选取1.3 节中敏感菌株4 株和抗性菌株5 株，测定其对甲基硫菌灵的敏感性。另外，随机选择6 个菌株分别测定其对戊唑醇、咪鲜胺和苯醚甲环唑的敏感性。各药剂的处理质量浓度见表1。

表1 敏感性测定中不同药剂处理质量浓度Table 1 The mass concentrations of different fungicides in the determination of sensitivity

各菌株分别在PDA 平板上活化培养3 d 后，用灭菌枪头沿菌落边缘打取直径5.0 mm 的菌饼，将带菌丝面朝下接种于含不同质量浓度药剂的PDA 平板中央，以未加入任何药剂但含相同浓度溶剂的PDA 平板为对照，每个浓度3 次重复。于25 ℃黑暗条件下培养4 d，采用十字交叉法测定各处理菌落直径 (mm)，取平均值后按公式 (2) 计算抑制率 (I/%)，利用SPSS 软件，通过浓度对数值 (x) 和抑制率几率值 (y) 之间的线性回归分析求出毒力回归方程和EC50值。

式中，dCK: 对照菌落直径；dT: 处理菌落直径。

1.6 甲基硫菌灵敏感和抗性菌株的适合度测定

1.6.1 菌丝生长能力测定 随机选取甲基硫菌灵敏感菌株4 株和抗性菌株5 株，分别在PDA 平板上于25 ℃黑暗条件下预培养3 d，用灭菌枪头沿菌落边缘打取直径5.0 m m 的菌饼，转接至PDA 平板中央，每个菌株6 次重复，于25 ℃黑暗条件下培养3 d，用十字交叉法测量菌落直径，取平均值代表菌丝生长能力[14]。

1.6.2 产分生孢子器能力测定 将1.6.1 节中测量直径后的菌株于25 ℃黑暗条件下继续培养1 d，待菌丝在平板上完全长满再转移至黑光灯下，照射6 d 后取出，统计每个菌株在整个平板内产生的分生孢子器数量，取平均值代表产分生孢子器能力[15]。

1.6.3 菌株致病力测定 参考王琼伟[15]的离体枝条接种技术。取粗细一致的山核桃新枝，将其截成长10 cm 左右小段，用封口膜缠绕枝条两端后用75%酒精擦拭枝条表皮并用无菌水擦拭3 次。在超净台中晾干后，用灭菌小刀在枝条中央处切割出直径5.0 mm 的小孔。用灭菌枪头沿预培养3 d的山核桃干腐病菌菌落边缘打取直径5.0 mm 的菌饼，接种于中央小孔中。将接种后枝条置于灭菌托盘中用胶带密封。于25 ℃黑暗条件下保湿培养5 d，测定病斑直径，取平均值代表菌株致病力。以无菌PDA 圆饼作为对照，每个处理重复3 次。

1.7 β-tubulin 序列扩增及比对

采用CTAB 法提取甲基硫菌灵敏感和抗性菌株的DNA。利用引物TubF/TubR (GTCAGGAG TCGCAGTCAGTAATTAG/CTTCATTTTGTCGCA TGTCTGGCTC)[16]对病原菌β-tubulin 基因进行扩增。25 μL PCR 反应体系：2 × PCR Mix 12.5 μL、各引物1.5 μL、ddH2O 8.5 μL、DNA 模板1 μL。扩增程序：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35 个循环，72 ℃延伸10 min。将PCR 扩增产物送至北京擎科生物科技有限公司进行测序，结果用DNAman软件进行序列比对和数据处理。

2 结果与分析

2.1 对甲基硫菌灵等四种杀菌剂的抗性频率

区分剂量法测定结果 (图1) 表明，96 株供试菌株中有81 株对甲基硫菌灵表现出抗性，抗性频率达84.38%。对于戊唑醇、咪鲜胺和苯醚甲环唑3 种DMI 类杀菌剂，96 株供试菌株均表现为敏感，没有检测到抗性菌株。

图1 山核桃干腐病菌 (n = 96) 对 4 种杀菌剂的抗性频率Fig.1 Resistance frequency of B.dothidea (n = 96) to the four fungicides

2.2 对甲基硫菌灵的敏感性

甲基硫菌灵在低浓度 (0.096 和0.48 μg/mL) 下对各菌株菌丝生长几乎不表现抑制效果，但随着浓度上升 (2.4、12 和60 μg/mL)，对菌丝生长有明显的抑制作用，在5 μg/mL 剂量下即能完全抑制敏感菌株的菌丝生长，而抗性菌株在12 μg/mL 甚至60 μg/mL 剂量下仍有菌丝生长。敏感菌株平均EC50值为0.263 μg/mL，抗性菌株的EC50值在13.126～22.309 μg/mL 之间 (表2)，相对抗性水平(抗性菌株EC50/敏感菌株平均EC50) 在49.9～84.8之间。LGBD18-1 (R) 13.126 c 69.2 d 81.7 c 12.7 b LGBD18-2 (R) 22.309 a 64.0 e 117.0 b 21.7 ab BDLA-7 (R) 17.356 b 69.9 d 51.7 d 27.0 ab BDLA-8 (R) 18.357 b 61.3 e 81.3 c 37.7 a TKBD18-7 (R) 15.209 bc 68.9 d 182.0 a 21.0 ab

表2 甲基硫菌灵敏感和抗性菌株的生物学性状Table 2 Biological characteristics of thiophanate-methylsensitive and -resistant isolates

2.3 对戊唑醇、咪鲜胺和苯醚甲环唑的敏感性

戊唑醇对随机选取的6 株山核桃干腐病菌菌丝生长的EC50值在0.061～0.279 μg/mL 之间，平均为0.148 μg/mL；咪鲜胺对6 株山核桃干腐病菌菌丝生长的EC50值在0.003～0.044 μg/mL 之间，平均为0.023 μg/mL；苯醚甲环唑对山核桃干腐病菌菌丝生长的EC50值在＜ 0.001～0.255 μg/mL 之间，平均为0.091 μg/mL (表3)。

表3 山核桃干腐病菌对戊唑醇、咪鲜胺和苯醚甲环唑的敏感性Table 3 Sensitivity of B.dothidea to tebuconazole,prochloraz and difenoconazole

2.4 对甲基硫菌灵敏感菌株和抗性菌株的适合度

各菌株在菌丝生长速率方面存在显著差异(表2)，大部分抗性菌株的生长速率显著低于敏感菌株 。敏感菌株几乎不产生分生孢子器，而抗性菌株均能产生大量分生孢子器，且数量显著高于敏感菌株。敏感菌株与抗性菌株的致病力 (以病斑直径表示) 无显著差异(P= 0.209) (图2)。

图2 对甲基硫菌灵敏感和抗性菌株的生长、产分生孢子器能力及致病力比较Fig.2 Comparison of mycelial growth, number of pycnidia, and pathogenicity of thiophanate-methyl-sensitive and -resistant isolates

2.5 β-tubulin 序列扩增及序列比对

对4 株敏感菌株和5 株抗性菌株的β-tubulin序列比对 (表4) 发现，敏感和抗性菌株的第198 位和第200 位氨基酸无差异，分别为谷丙氨酸(E)和异亮氨酸(F)。供试菌株在β-tubulin第70、90、119、380 和541 位的氨基酸存在差异，但这些差异与菌株是否具有抗药性之间无联系，也未有文献报道过上述位点与病原菌对甲基硫菌灵的抗性有关。

表4 山核桃干腐病菌对甲基硫菌灵敏感和抗性菌株的β-tubulin 氨基酸差异Table 4 Difference of amino acids of β-tubulin from thiophanate-methyl-sensitive and -resistant isolates of B.dothidea

3 结论与讨论

本研究测定了山核桃干腐病菌对戊唑醇、咪鲜胺及苯醚甲环唑的敏感性，3 种杀菌剂对所测定的山核桃干腐病菌EC50平均值分别为0.148、0.023和0.091 μg/mL，表明供试山核桃干腐病菌对3 种杀菌剂仍然表现较高的敏感性，未出现明显的敏感性下降，在实际生产中仍可以继续使用以防治山核桃干腐病。戊唑醇和苯醚甲环唑对于多种寄主上B.dothidea有良好的抑制效果[17-18]。张传清等[14]研究发现，山核桃干腐病菌对戊唑醇和苯醚甲环唑有较高的敏感性水平，戊唑醇对山核桃干腐病菌的EC50平均值为0.81 μg/mL；安徽和浙江两省山核桃干腐病菌对苯醚甲环唑的敏感基线EC50为(0.43 ± 0.11) μg/mL。本研究结果与之相似。

本研究发现山核桃干腐病菌中已经有大量菌株对甲基硫菌灵产生了抗性。而刘保友等[19]和成世杰等[20]报道，甲基硫菌灵对苹果轮纹病菌仍然有较高的活性，未出现敏感性下降的亚群体。出现这种差异可能是分离的菌株产地不同以及甲基硫菌灵在两种病原菌防治上的使用情况不同导致的。

王丽等[16]研究发现，苹果轮纹病菌抗多菌灵菌株和敏感菌株在菌丝生长速率、子囊壳数量和致病性方面均无显著差异。刘方圆[21]报道，抗多菌灵的小麦赤霉病菌菌丝生长速率显著低于敏感菌株，而两者在产子囊壳能力方面却无显著差异。本研究发现，山核桃干腐病菌中，甲基硫菌灵抗性菌株和敏感菌株在致病力方面无显著差异，这与王丽等[16]的研究结果相吻合；敏感菌株的菌丝生长速率显著高于抗性菌株，这与刘方圆[21]的研究结果相同；但分生孢子器的数量明显少于抗性菌株，这与以往的报道不太一致，可能是因为分离自不同寄主植物的B.dothidea之间本身存在差异。适合度测定结果表明，对甲基硫菌灵产生抗性的山核桃干腐病菌的适合度代价较小，使其能够在种群中达到较高的比例，说明山核桃干腐病对这类杀菌剂的抗性风险较高。

本研究测定并比对了山核桃干腐病菌中甲基硫菌灵抗性菌株和敏感菌株的β-tubulin序列，发现抗性菌株β-tubulin的第198 位和第200 位氨基酸均未发生突变，且未发现其他与抗性有关的突变位点。这表明，山核桃干腐病菌对甲基硫菌灵抗性的产生与β-tubulin序列的突变无关，其他病原菌中也报道过类似现象，如Penicillium digitatum中的PMR5 蛋白和Colletotrichum acutatum中的CaABC1 蛋白均与包含MBCs 在内的多种杀菌剂抗性有关[22-24]。而Cabañas 等[22]研究发现，从田间获得的苯并咪唑类抗性青霉菌菌株普遍在β-tubulin序列第198 或200 位发生突变。王丽等[16]也报道了苹果轮纹病菌中19 株多菌灵抗性菌株在β-tubulin序列发生了E198A 突变。因此，本研究中发现的对甲基硫菌灵产生抗性的菌株，很可能涉及靶标基因突变以外的抗性机制，尚有待进一步研究。

本研究通过评估山核桃干腐病菌田间群体对甲基硫菌灵、戊唑醇、咪鲜胺和苯醚甲环唑的抗性发生情况及敏感性现状，发现山核桃干腐病菌对甲基硫菌灵抗性频率较高，但对戊唑醇、咪鲜胺和苯醚甲环唑仍保持敏感，因此建议在浙江省临安山核桃主产区生产上进行病害防治时尽量减少苯并咪唑类杀菌剂如甲基硫菌灵的使用，可以选择DMIs 类杀菌剂进行病害防治，从而达到病害精准、可持续防控的目的。