抽拔辅助分散固相微萃取技术用于饮料中5 种杀菌剂残留检测研究

康琬琳, 张艳超, 宋惜木, 席雪霏, 高海翔, 周文峰

(中国农业大学 理学院 应用化学系，北京 100193)

嘧菌酯、三唑酮、百菌清，嘧菌环胺和肟菌酯为农业生产中常用的杀菌剂，广泛被用于防治农作物上的粉霉病、霜霉病、小麦白粉病和炭疽病等病害[1-2]。但随之大量使用，可能导致杀菌剂在农产品中出现不同程度的残留问题，并且部分杀菌剂具有潜在毒性、内激素破坏作用、致癌物以及低量毒性的特性，对人类健康存在潜在风险[3]。国家标准中规定上述5 种杀菌剂的ADI (每日允许摄入量) 范围为0.02～0.2 mg/(kg bw)[4-5]。因此，近年来，食物中杀菌剂残留的微量检测技术引起了广泛关注，开发简便、绿色、灵敏度高且易于操作的测定杀菌剂残留的分析方法具有重要意义。

目前，实际复杂样品的前处理方法主要有液液萃取 (LLE)[6]、液液微萃取 (LLME)[7]、固相萃取 (SPE)[8]和固相微萃取 (SPME)[9]等。相较于SPE 等传统方法，分散固相微萃取 (d-SPE) 方法在萃取效率和环保性上具有明显优势，在从复杂样品基质中萃取杀菌剂的实际应用中表现优良[10]。在d-SPE 方法中，萃取材料通常被制备成纳米粒子 (NPs)，通过旋涡或超声波将一小部分萃取材料分散在样品溶液中。萃取后，通过离心作用可以快速将含有萃取物的萃取材料分离出来，然后用少量有机溶剂洗脱待分析物。

在d-SPE 的过程中，常用的萃取材料主要有十八烷基硅烷键合硅胶 (C18) 等。考虑到环境和经济问题，研究人员越来越多地关注将廉价的天然陶土矿物作为萃取材料的替代品[11-12]。坡缕石(ATP) 是一种具有大表面积、多孔结构和离子交换能力的纤维型硅酸盐陶土矿物，在中国储量较大[13]，其吸附作用机制主要为吸附和离子交换，但这种吸附和离子交换能力对有机污染物不具有特异性。对吸附剂进行适当的功能性基团修饰是提高吸附剂分离能力的有效方法[14]。β-环糊精 (β-CD) 的独特疏水空腔和亲水壁的化学结构使其能够捕获特定尺寸和极性的目标物，在内部空腔形成超分子作用，并具有选择特定分析物的能力[15]。已有研究证明，通过将β-环糊精和坡缕石结合使用，选择性得到了显著提高，进而有效地提高了分析效率[16]。离子液体 (IL) 被认为是“绿色溶剂”，具有蒸气压力可忽略不计、化学和热稳定性，以及在有机和无机介质中具有良好的溶解性等优点，广泛应用于绿色分析化学领域[17]。此外，离子液体能够通过π-π 键、n-π 键、氢键、偶极相互作用和静电作用与分析物相互作用。研究人员利用这些突出特质，已将离子液体负载到不同纳米尺度的载体上用于分离分析[18-19]。

本研究使用坡缕石作为新型的离子液体修饰的吸附剂，从果汁和茶饮料样品中萃取杀菌剂，通过控制单一变量法和正交试验设计得出影响微萃取的因素，拟建立一种d-SPE 方法，并用于实际样品中杀菌剂的测定以验证其效果。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

安捷伦1100 HPLC (高效液相色谱) 系统 (美国安捷伦公司)；梅特勒-托利多AL104 电子天平(精确至0.0001 g，瑞士梅特勒-托利多公司)；Zonkia SC-3610 低速冷冻离心机 (中国安徽中佳中科公司)；KQ3200DE 超声仪 (中国昆山舒美有限公司)；JSM-6700F 扫描电子显微镜 (日本Jeol 电子株式会社)；IRtrace-100 傅立叶变换红外光谱仪(日本岛津公司)；DSX-300 核磁共振波谱仪 (德国布鲁克上海有限公司)。

嘧菌酯 (azoxystrobin)、三唑酮 (triadimefon)、百菌清 (chlorothalonil)、嘧菌环胺 (cyprodinil) 和肟菌酯 (trifloxystrobin) 标准品，纯度均大于99.0%，由农业农村部环境保护科研监测所提供。色谱纯乙腈，购于迪马公司 (美国，加利福尼亚州)；分析纯氯化钠和乙醇，购于北京化工有限公司，1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐 ([HMIM][PF6])和1-己基-3-甲基咪唑氯化物 ([HMIM]CL) ，购于中国科学院绿色化学与催化中心 (中国，兰州)；双 (三氟甲基磺酰胺)，购于中国浙江九州制药公司；坡缕石 (attapulgite)，由中国科学院兰州化学物理研究所提供；β-环糊精、N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)、氢化钠 (NaH)和γ-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷 (KH-560)，购于中国上海国药集团化学试剂公司；0.22 μm 聚醚砜 (PES) 滤膜，购于中国比克曼公司。

1.2 样品准备

绿茶、红茶、葡萄汁和苹果汁4 种饮料样品从本地超市 (中国，北京) 采购。准确称取杀菌剂标准品，用乙腈溶解，配制成质量浓度为 100 mg/L的标准储备液，再用乙腈稀释成系列质量浓度(5、10、50、100、125、200 和500 μg/L)的标准溶液。在对样品进行分析之前，两种茶饮料样品无需离心和过0.22 μm 滤膜；两种果汁样品在4000 r/min 下离心10 min，过0.22 μm PES 滤膜。4 种样品各取50.0 mL，加入标准储备液，配制成目标浓度样品溶液；空白样品进行相同处理，但不加入标准储备液。所有样品均于4 ℃条件下储存，备用。

1.3 试验方法

1.3.1 离子液体的制备以及离子液体涂覆β-环糊精/坡缕石的合成

1.3.1.1 离子液体的制备 1-己基-3-甲基咪唑氯化物和等质量的双 (三氟甲基磺酰亚胺) 在去离子水中经离子交换反应，制成1-己基-3-甲基咪唑双(三氟甲基磺酰亚胺) 离子液体([HMIM][NTF2])，其制备方法如下：

在1 L 单颈圆底烧瓶中加入1-己基-3-甲基咪唑氯化物20.2 g (0.1 mol)和双(三氟甲基磺酰亚胺) 28.7 g (0.1 mol)，加入70 mL无水乙醇，在室温下搅拌2 h，形成两相体系。有机相用3 × 50 mL 水洗涤，减压(0.01 kPa, 0.001 mm)干燥。然后加入100 mL 二氯甲烷和35 g 无水硫酸镁，搅拌1 h，过滤除去不溶物，再在30 ℃、减压(0.01 kPa, 0.1 mm) 条件下蒸发2 h，得浅黄色黏稠液体，即1-己基-3-甲基咪唑双(三氟甲基磺酰亚胺)37.2 g (收率95%)。离子液相用水洗涤6～8 次后，在真空炉中50 ℃干燥8 h，去除水相，得目标离子液体。

1.3.1.2 离子液体涂覆的β-环糊精/坡缕石(β-CD/ATP)纳米复合材料的合成 分为两个步骤[20]：

第1 步，将坡缕石进行酸化。准确量取100 mL 3.0 mol/L 的盐酸溶液，加入坡缕石中，在室温下搅拌3 h，过滤，用去离子水反复洗涤，直到滤液呈中性；将经过初步处理的坡缕石置于110 ℃烘箱中干燥8 h 后，悬浮于150 mL 无水甲苯中，加入1.5 g KH-560 和1 mL 三乙胺，在90 ℃及氮气保护下通过电磁搅拌回流24 h；用甲苯、乙醇、蒸馏水和丙酮依次洗涤沉淀物 (Si-ATP)，然后在60 ℃下真空干燥8 h；将重结晶的β-环糊精溶解于100 mL 无水DMF 中，加入0.3 g NaH，于室温下搅拌，直到没有气体排出，过滤去除过量的NaH；向溶液中加入5.0 g Si-ATP，在110 ℃及氮气保护下搅拌12 h；用DMF、甲醇和蒸馏水依次洗涤反应产物β-环糊精/坡缕石复合物，然后在60 ℃真空下干燥，即得固体β-环糊精/坡缕石。

第2 步，将离子液体固定在β-环糊精/坡缕石表面。将1 g 离子液体分散在6 mL 乙醇中，加入1 gβ-环糊精/坡缕石，于室温下搅拌30 min，然后在60 ℃真空下干燥6 h，即得离子液体 (IL)涂覆的β-环糊精/坡缕石(β-CD/ATP)纳米复合材料。

1.3.2 离子液体涂覆β-环糊精/坡缕石分散固相微萃取步骤 将含有目标分析物的8 mL 均匀样品溶液装入10 mL 聚四氟乙烯管中，加入40 mg 离子液体涂覆β-环糊精/坡缕石 (由[HMIM][NTF2]修饰的β-CD/ATP)，用10 mL 注射器进行6 次分散；过0.22 μm 的PES 滤膜，将纳米粒子从样品溶液中分离出来，然后用600 μL 丙酮进行7 次洗脱以提取分析物；将洗脱液转移至另一支管中，在50 ℃下用氮气吹干，用60 μL 乙腈重溶，待HPLC 测定。微萃取流程示意图见图1。

图1 离子液体涂覆β-环糊精/坡缕石抽拔辅助分散固相微萃取流程示意图Fig.1 Schematic diagram of the ionic liquid-coated β-cyclodextrin/attapulgite syringe-assisted dispersive solid phase mixroprocess

1.4 方法验证

外标法定量。用蒸馏水稀释标准储备液，配制成5、10、50、100、125、200 和500μg/L 系列质量浓度的标准工作溶液，然后使用离子液体涂覆β-环糊精/坡缕石进行d-SPE。在5～500 μg/L 范围内使用标准溶液建立校准曲线，通过相对标准偏差 (RSD，n=3) 在1 或2 d 内评估提取过程的精密度，峰值出现在50 μg/L 处。计算相应杀菌剂类农药的平均回收率来评估测量的正确度。

1.5 富集因子和萃取回收率的计算

萃取性能通过回收率 (R) 来评估，回收率定义为从最终有机溶液 (nc) 中收集的目标分析物和水样中最初添加的分析物 (n0) 的百分比。富集因子(EF) 定义为有机相 (Cc) 中分析物浓度与样品中分析物浓度 (C0) 的比值。R和EF可通过公式 (1) 和(2) 计算。

式中，Vc和Vaq分别表示最终有机相和样品溶液的体积。Cc根据将不同浓度的标准溶液直接注入HPLC 获得的标准校准曲线计算。

2 结果与讨论

2.1 离子液体涂覆β-环糊精/坡缕石的特性

图2 展示了坡缕石、β-环糊精/坡缕石和离子液体涂覆β-环糊精/坡缕石的傅立叶变换红外光谱(FT-IR)。

图2 FT-IR 表征：(a)坡缕石；(b)β-环糊精/坡缕石；(c) 离子液体涂覆β-环糊精/坡缕石Fig.2 FT-IR characterization of (a) attapulgite, (b) βcyclodextrin/attapulgite, and (c) ionic liquid coated β-cyclodextrin/attapulgite

对于离子液体涂覆β-环糊精/坡缕石，在3620～3580 cm-1范围内的宽峰是与八面体镁和四面体硅配位的羰基伸缩振动信号。与坡缕石相比，β-环糊精/坡缕石和离子液体涂覆β-环糊精/坡缕石在2939 cm-1和2882 cm-1处的吸收峰强度更强，这些峰对应于与β-环糊精配位的-CH-基团的伸缩振动。在2800 cm-1和300 cm-1处，特征峰清晰地显示了咪唑环氮原子处烷基的-CH-伸缩振动。3249 cm-1处的特征峰由-C-H-基团的伸缩振动引起的两个峰构成。此外，1138 cm-1和1058 cm-1处的峰是由于O-S-O 的非对称和对称伸缩振动。

通过扫描电镜 (SEM) 图像证明了β-环糊精/坡缕石以及由此产生的离子液体涂覆β-环糊精/坡缕石纳米复合材料的存在 (图3)。将离子液体涂覆在β-环糊精/坡缕石上保持了坡缕石吸附材料的固体特性，这显示出疏水性离子液体在固体吸附材料方面具有潜力。

图3 扫描电镜表征：(a) 坡缕石； (b) β-环糊精/坡缕石； (c) 离子液体涂覆β-环糊精/坡缕石Fig.3 SEM of (a) attapulgite，(b) β-cyclodextrin/attapulgite，and (c) ionic liquid coating β-cyclodextrin/attapulgite

2.2 萃取条件的优化

采用控制单一变量法确定萃取条件对分散固相微萃取的影响。确定最佳方案，进一步使用正交试验设计 (OAD) 和方差分析 (ANOVA) 方法确定影响提取效率的因素及其与主要因素之间的关系。结果表明，萃取材料质量对萃取效率的影响最大。

2.2.1 吸附剂纳米粒子的选择 由表1 可知：离子液体涂覆β-环糊精/坡缕石的回收率高于其他类型的坡缕石，提取性能更好，可能是由于离子液体涂覆β-环糊精/坡缕石具有较大的表面积、较强的阴离子交换能力以及离子液体和坡缕石的物理吸附性能。β-环糊精的存在可能提高了吸附剂与目标物之间的灵敏度。因此，在后续试验中选择离子液体涂覆β-环糊精/坡缕石颗粒作为固体吸附剂。

表1 材料吸附萃取性能对比Table 1 Comparison of adsorption performance of the materials

2.2.2 纳米颗粒质量的优化 在分散固相微萃取过程中，需要使用注射器将样品泵送至分散状态进行萃取，然后使用滤膜从萃取样品中提取吸附材料，最后进行脱附。因此，本研究考察了不同萃取材料用量 (10、20、30、40 和50 mg) 对萃取效果的影响。结果 (图4a) 显示，当萃取材料用量为40 mg 时获得了最佳的萃取效果，并且数据平行性良好。

图4 (a) 萃取剂用量、(b) 洗脱剂种类、(c) 洗脱剂体积、(d) 抽拔分散次数、(e) 抽拔洗脱次数、(f) 洗脱间隔对萃取效果的影响Fig.4 Effect of (a) dosage of extractant; (b) type of eluent; (c) volume of eluent; (d) dispersion pumping times;(e) pumping elution times; and (f) interval of elution on the extraction efficiency

2.2.3 洗脱剂的选择 比较了乙腈、甲醇、丙酮和乙醇4 种常用有机溶剂作为洗脱剂对5 种杀菌剂的洗脱效果。综合考虑试验结果、溶剂的毒性、成本和对环境的影响，发现丙酮效果最好，因此最终选择丙酮作为洗脱剂 (图4b)。

2.2.4 洗脱剂体积的优化 为了进一步提高洗脱剂对分析物的解吸效率，比较了不同体积的丙酮对回收率的影响。结果 (图4c) 显示，当丙酮体积为600 μL 时平均回收率最高，并且数据平行性良好。因此，选择600 μL 丙酮为洗脱剂。

2.2.5 抽拔分散循环次数的优化 在试验过程中，采用注射器辅助分散技术将萃取吸附材料均匀分散在样品溶液中。通过试验发现，进行6 次循环后，萃取效率已经趋于饱和 (图4d)，继续增加提取次数会导致提取剂在残渣中的残留量增加，从而降低回收率并影响数据平行性。因此，采用6 次抽拔循环来分散萃取材料。

2.2.6 抽拔洗脱循环次数的优化 为了提高洗脱液中吸附物质对目标分析物的洗脱效率，采用了多次循环洗脱的方法。在预试验结果的基础上，研究了洗脱1、3、5、7、9 次对萃取效率的影响。结果 (图4e) 发现，在进行7 次抽拔洗脱后，目标分析物的洗脱已经基本完成，此时平均回收率最高，继续增加抽拔次数，回收率没有明显变化。因此，采用7 次抽拔循环来进行目标物的洗脱。

2.2.7 正交试验和方差分析 本研究设计了[L25(54)] 正交试验来评估可能影响提取效率的4 个潜在因素。为排除人为因素，共进行了25 组随机模拟试验 (表2)，重复3 次。通过方差分析，得出了各种参数的系数R值，结果 (表3) 显示，萃取剂用量 ＞ 抽拔分散循环次数 ＞ 抽拔洗脱循环次数 ＞ 洗脱剂用量。萃取剂用量置信水平为95%，F值为67.93，P值为0.004，表明萃取剂用量是影响提取回收效率最重要的因素。因此，最佳组合参数为：40 mg 萃取剂，6 次抽拔分散循环，7 次抽拔洗脱循环和600 μL 丙酮洗脱。

表2 正交试验设计和分析结果Table 2 Orthogonal test design and analysis of results

表3 方差分析结果Table 3 ANOVA

2.3 萃取材料的日间洗脱率变化

在实际工作中，完成样品萃取后的材料不能立即用于后续的试验步骤，需要通过抽拔分散萃取和固液分离，在相对较长的时间内记录和保存样品中分析物的浓度状况，以供未来的分析和研究使用。萃取材料完成抽拔分散和固液分离后，用滤膜封装，并在滤膜的两端使用密封膜进行密封。随后，在0、24、48、72 和96 h 的时间间隔点进行洗脱，通过回收率来评估萃取材料对目标物的保存分析能力。结果 (图4f) 显示，5 种分析物的平均回收率均未明显下降，表明萃取材料对分析物具有良好的保留能力，并延缓了分析物的自然降解。

2.4 方法验证

在空白样本中添加特定浓度化合物进行检测，以3 倍信噪比对应的被测化合物的含量为检出限，以10 倍信噪比对应的被测化合物的含量为定量限。结果表明：在水基质 (表4) 中，标准曲线呈良好的线性关系，决定系数 (R2) 在0.9982～0.9999 之间，尖峰浓度在5～500 μg/L 范围内；检出限 (LOD) 在0.03～0.38 μg/L 之间；定量限 (LOQ)在0.09～1.15 μg/L 之间，远小于欧盟制定的嘧菌酯等农药在茶水饮料中的LOQ 值 (0.05 mg/L)[21]，该方法适用于实际样品测量；日内精密度的RSD 值在1.6%～3.1%之间，日间RSD 值在1.8%～4.1%之间，表明该方法具有出色的检测能力。在果汁基质 (表5) 中，R2在0.9980～0.9989 之间，尖峰质量浓度在5～500 μg/L 内，回收率在90%～100%之间； LOD 在0.27～0.44 μg/L 之间； LOQ 在0.30～1.33 μg/L 之间，日内精密度的RSD 值在1.8%～4.6%之间，日间的RSD 值在1.8%～3.6%之间，表明该方法在果汁基质中同样呈现良好线性关系并且有出色的检测能力。

表4 抽拔分散固相萃取方法用于水中目标物分析的确证参数(n=3)Table 4 syringe-assisted dispersive solid-phase microextraction method of confirming water matrix (n=3)

表5 抽拔分散固相微萃取方法用于果汁基质中目标物分析的确证参数Table 5 Confirmation parameters of syringe-assisted dispersive solid phase microextraction method for target substance analysis in fruit juice matrix

2.5 实际样品分析

运用本研究建立的方法对从当地市场购买的葡萄汁、苹果汁、绿茶和红茶4 种饮料样品进行了验证。结果未检出目标农药 (表6)。添加回收试验结果表明：5 种杀菌剂添加水平为50 μg/L 时，回收率在82%～106%之间；当添加水平为200 μg/L时，回收率在83%～100%之间；典型的色谱图如图5 所示。

表6 实际样品添加回收试验结果Table 6 The test results in spiked real samples

图5 5 种农药在绿茶饮料中的添加回收色谱图Fig.5 Chromatograms of the 5 pesticides in green tea beverage

3 结论

本研究通过简单的直接浸渍法制备了一种新型吸附剂，即β-环糊精/坡缕石固定化离子液体纳米粒子。合成的复合材料结合了离子液体、β-环糊精和坡缕石的优点，具有良好的吸附能力和选择性。该复合材料被应用于空气辅助泵送分散模式中，用于富集饮料中的杀菌剂。在优化的条件下，该技术可高效测定茶饮料和果汁样品中杀菌剂的残留，具有较高的精密度和正确度；检出限为0.03～0.38 μg/L，远低于普通固相微萃取和气相色谱-质谱联用仪检测方法的检出限[16]，对于5 种杀菌剂，可检测的线性范围为5～500 μg/L，决定系数 (R2) 在0.9982～0.9999 之间，回收率在91%～102%之间。本方法简便、灵敏、成本效益高且环境友好。该方法将为全面提取测定不同基质中的污染物提供技术支持，并在富集和测定其他环境污染物方面具有较大潜力。此外，该方法还可作为开发低成本、灵敏的农药残留检测方法的可能选择。