血清ADA、IL-10及TLR9与EBV相关传染性单核细胞增多症患儿EBV-DNA载量的相关性*

李 萍,安莉莉,韩 冰

日照市妇幼保健院儿科,山东日照 276800

传染性单核细胞增多症(IM)是一种单核-巨噬细胞系统急性增生性疾病,多由EB病毒(EBV)、支原体、腺病毒、巨细胞病毒等诸多病原菌感染所致[1-2]。其中EBV属于嗜B淋巴细胞DNA病毒,EBV进入宿主体内后多附着于B淋巴细胞,是引起IM最主要的病原体之一[3]。EBV相关IM患儿典型症状为颈淋巴结肿大、发热、咽峡炎三联征,多发于学龄前与学龄期儿童。本病多呈良性、自限性,虽大部分预后良好,但仍有少数患儿会伴有噬血综合征、周围神经炎、肝损伤等严重并发症,加之因部分患儿早期无特异性血液学表现,常与其他感染性疾病混淆[4]。因此,积极探讨一种灵敏度高、特异度高的血清生物学标志物,在早期识别EBV相关IM的高危人群、评估病情程度中尤为关键。EBV抗体检测是临床诊断IM的主要方式,但存在反应弱等不足。研究发现,多种抗原提呈细胞(如树突状细胞、单核细胞等)表面的Toll样受体(TLRs)于EBV感染早期可识别病毒蛋白,TLRs是机体免疫应答的主要启动因子[5-6]。而免疫失调与炎症反应协同作用可能是促使EBV从潜伏状态转变为增殖状态,致使IM患者预后不良的重要原因[7]。基于此,本研究分析血清腺苷脱氨酶(ADA)、白细胞介素(IL)-10、Toll样受体9(TLR9)水平与EBV相关IM患儿EBV-DNA载量的相关性,旨在为EBV相关IM的临床诊断提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 前瞻性选择2021年2月至2022年12月就诊于本院的98例EBV相关IM患儿作为IM组,其中男55例,女43例;年龄1～10岁,平均(4.02±1.53)岁;体重指数(20.85±1.32)kg/m2。另选同期于本院体检的50例健康儿童(近6个月未发生病毒感染)作为对照组,其中男27例,女23例;年龄1～10岁,平均(4.18±1.65)岁;体重指数(20.57±1.28)kg/m2。IM组、对照组上述资料比较,差异无统计学意义(P>0.05),有可比性。本研究已获院内医学伦理委员会批准(20210013)。

1.2IM组入选标准 纳入标准:符合EBV相关IM诊断标准[8];EBV特异性抗体阳性;发病时间<1周;初诊;入组前未接受免疫抑制剂、抗菌药物、糖皮质激素等治疗;患儿家属自愿签署知情同意书。(2)排除标准:因支原体、腺病毒、巨细胞病毒等其他病原菌诱发的IM;合并扁桃体炎、肺炎等其他类型感染;生长缓慢且发育异常;伴有器质性损伤、血液系统疾病、遗传性疾病;先天畸形。

1.3方法

1.3.1标本采集与处理 采集对照组体检当日、IM组入院24 h内的空腹静脉血3 mL,注入离心管,置入SCILOGEX SCI506型低速离心机(苏州瑞诺德生物科技有限公司)上离心15 min,温度为4 ℃,转速为3 000 r/min,离心半径为10 cm,取血清置于Thermo Scientific HERAfreezeTM-80 ℃超低温冰箱(上海辅泽商贸有限公司)中待测。

1.3.2血清ADA、IL-10、TLR9水平检测 从冰箱中取出血清标本,室温下解冻,取血清标本放置AU640型全自动生化分析仪(日本奥林巴斯公司),利用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(试剂盒购自上海羽哚生物科技有限公司,货号:YDLC-4577)测定血清IL-10、TLR9水平,采用酶比色法(试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司,货号:SNM220-NDR)测定ADA水平。

1.3.3EBV-DNA载量 利用cobas z480型全自动荧光定量PCR分析仪(瑞士罗氏公司)与配套试剂盒测定血清中EBV-DNA载量,反应总体系为20 μL,扩增条件:93 ℃ 2 min,93 ℃ 45 s,55 ℃ 45 s,共30个循环,EBV-DNA>500 copy/mL则为EBV-DNA阳性。参考相关标准[9]将IM组患儿分为低载量组(<6 000 copy/mL,18例)、低-中载量组(6 000～<30 000 copy/mL,25例)、中-高载量组(30 000～<300 000 copy/mL,49例)、高载量组(≥300 000 copy/mL,6例)4个亚组。

2 结 果

2.1两组血清ADA、IL-10及TLR9水平比较 与对照组比较,IM组血清ADA、IL-10、TLR9水平升高(P<0.05)。见表1。

表1 两组血清ADA、IL-10及TLR9水平比较

2.2血清ADA、IL-10及TLR9水平与IM发生的关系 线性回归分析结果显示,ADA、IL-10、TLR9水平均与EBV相关IM的发生有关(P<0.05)。见表2。

表2 血清ADA、IL-10及TLR9水平与IM发生的关系

2.3血清ADA、IL-10、TLR9水平单独及联合预测EBV相关IM发生的价值 将IM发生状态(0为发生,1为未发生)作为状态变量,将血清ADA、IL-10、TLR9水平作为检验变量,ROC曲线结果发现血清ADA、IL-10、TLR9水平单独及联合预测EBV相关IM发生的曲线下面积(AUC)为0.850(95%CI0.791～0.910)、0.867(95%CI0.811～0.924)、0.891(95%CI0.840～0.943)、0.912(95%CI0.843～0.956)。见表3。

表3 血清ADA、IL-10、TLR9水平及联合预测EBV相关IM发生的价值

2.4IM组不同EBV-DNA载量患儿血清ADA、IL-10、TLR9水平比较 血清ADA、IL-10、TLR9水平及EBV-DNA载量从高到低为高载量组、中-高载量组、低-中载量组、低载量组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 IM组不同EBV-DNA载量患儿血清ADA、IL-10、TLR9水平比较

2.5血清ADA、IL-10、TLR9水平与EBV相关IM患儿EBV-DNA载量的相关性分析 Spearman等级相关结果显示,血清ADA、IL-10、TLR9水平与EBV相关IM患儿EBV-DNA载量呈正相关(r>0,P<0.05)。见表5。

表5 血清ADA、IL-10、TLR9水平与EBV相关IM患儿EBV-DNA载量的相关性分析

3 讨 论

EBV-DNA是来自于淋巴细胞中释放的病毒颗粒,EBV-DNA载量可动态反映机体感染EBV后的病毒水平,故常用于原发性IM的早期诊断中。但研究发现,虽部分患儿从发病第2周后开始出现EBV-DNA转阴,但仍有小部分患儿从发病至痊愈一直呈阴性,存在一定的漏检率,故临床仍需联合其他指标进行诊断[10]。

现有研究认为,EBV进入机体后与B淋巴细胞表面受体CD21结合感染成熟B淋巴细胞,并在B淋巴细胞中建立终生潜伏感染,激活自然杀伤细胞与树突状细胞,进一步促进EBV增殖与细胞转化[11-12]。且机体在受到免疫刺激、免疫抑制或慢性炎症等因素刺激时,潜伏于B淋巴细胞中的EBV被重新活化并大量传播、繁殖[13]。由此可见,免疫机制与EBV所致的相关疾病有关,而诸多与免疫机制相关的免疫因子、炎症因子可能在EBV相关IM发病过程中发挥关键作用。B淋巴细胞表面的潜伏膜蛋白LMP1是TLR9转录的强抑制剂,EBV-DNA基序可激活TLR9,而浆树突细胞可通过TLR9分子识别EBV颗粒中的线性病毒DNA。因此,干扰浆树突细胞TLR9信号通路可通过抑制TLR9启动子活化,活化自然杀伤细胞,抑制TLR介导的核因子-κB信号通路活化等途径,从而削弱机体固有免疫反应,促进EBV病毒长期生存[14]。VALENTE等[15]研究发现,TLR9表达上调可促进干扰素调节因子7产生,刺激EB病毒潜伏膜蛋白1基因表达,从而促进病情进展。NOOR等[16]研究报道,TLR9主要表达于B淋巴细胞表面,EBV感染激活淋巴细胞上TLR9表达,并借助细胞因子逃避宿主的免疫杀伤作用。IL-10属于一种抗炎因子,可抑制健康者树突状细胞的生长速度及向成熟活化的树突状细胞转化,诱导细胞毒性T淋巴细胞对抗原产生耐受,限制机体对抗原的过度免疫反应,从而保护机体免受免疫损伤。目前已有研究证实,IL-10基因多态性与儿童EBV感染易感性、肝功能损伤有关[17-18],但关于EBV相关IM患儿血清IL-10表达及意义的报道较少。本研究中,IM组血清TLR9、IL-10水平比对照组高,TLR9、IL-10水平均与EBV相关IM患儿EBV-DNA载量呈正相关,与SKOVBJERG等[19]研究结果相似,进一步证实TLR9、IL-10水平与EBV相关IM的发生,病情程度有关,推测原因可能在于:(1)EBV感染可通过TLRs信号通路诱导机体炎症反应,使机体识别抗原,激活免疫反应,并协助EBV的免疫逃逸,降低机体抗病毒能力;(2)TLRs可识别EBV膜蛋白,并将信号传递至细胞内各类接头分子,刺激自然杀伤细胞活化,并经诸多途径来刺激下游炎症因子释放,从而启动适应性免疫应答。线性回归分析结果显示,TLR9、IL-10水平与EBV相关IM的发生有关(t=3.875、2.210),且进一步绘制ROC曲线发现,血清TLR9、IL-10水平预测EBV相关IM发生的AUC为0.891、0.867,当TLR9、IL-10最佳临界值分别取2.987 ng/mL、10.521 pg/mL时,其诊断效能最高,提示临床应高度警惕血清TLR9、IL-10水平异常升高的EBV患儿,并采取针对性治疗措施,以预防IM的发生。

ADA是核酸代谢期间的关键酶,主要存在于淋巴细胞、胸腺、脾等组织中,不仅参与嘌呤核苷代谢过程,且与细胞免疫活性及淋巴细胞增殖密切相关。沈伟等[20]研究报道,血清ADA活性变化与异型淋巴细胞有关,EBV相关IM患儿异型淋巴细胞水平上升会释放大量ADA。SHI等[21]在一项回顾性、大样本量研究中共收集6 868例患儿的临床资料,多因素Logistic回归分析显示,EBV感染是导致血清ADA水平升高的危险因素(OR=8.486,95%CI6.753～10.663),且ADA水平与EBV-ADA载量呈正相关(r=0.501)。本研究发现,IM组血清ADA呈高表达,且血清ADA水平与EBV-ADA载量呈正相关,与上述研究结果报道一致,推测原因可能在于:(1)细胞毒性T淋巴细胞靶向攻击受感染的B淋巴细胞,进一步损伤B淋巴细胞功能,从而致使大量ADA被释放入血;(2)EBV感染后会启动T淋巴细胞对病毒抗原刺激的细胞免疫应答,激活单核巨噬细胞与淋巴细胞,造成淋巴细胞中ADA水平升高;(3)此外,EBV入侵血液系统后会形成病毒血症,并与自然杀伤细胞、B淋巴细胞及T淋巴细胞的EBV受体结合,激活T淋巴细胞并使其变形,从而产生异型淋巴细胞。而异型淋巴细胞凋亡后会促使大量ADA被释放,形成恶性循环。进一步绘制ROC曲线发现,血清ADA、IL-10、TLR9水平单独及联合预测EBV相关IM发生的AUC为0.850、0.867、0.891、0.912,提示针对临床特征不典型,但血清ADA、IL-10、TLR9水平升高的EBV感染患儿,其罹患IM的风险较高。

综上所述,EBV相关IM患儿血清ADA、IL-10及TLR9水平异常升高,上述指标水平与EBV-DNA载量密切相关,且三者联合可有效预测EBV相关IM的发生。