上皮间质转化相关基因水平评估肝癌免疫治疗疗效的应用价值*

韩 雪,李 帅,徐 蓉,马文静,黄国虹△

新疆维吾尔自治区人民医院:1.检验科;2.肿瘤科,新疆乌鲁木齐 830001;3.新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市中医医院检验科,新疆乌鲁木齐 830002

肝癌是世界范围内最常见的致命性恶性肿瘤,肝细胞癌约占所有肝癌90%,具有高发病率和高死亡率的特点,中国是全球肝癌高负担国家之一,患者确诊时往往进展为癌症晚期,预后不良[1-3]。手术切除仍是治疗早期肝细胞癌最有效的方法,但大多数患者在就诊时已为晚期,无法切除,此外,由于手术切除后复发和转移率较高,患者预后仍不理想,早期识别可有效预测肝癌的生物标志物对准确评估患者预后具有重要意义[4-5]。上皮间质转化(EMT)常发生在肿瘤侵袭和转移的开始,是恶性肿瘤侵袭转移的早期征象,表现为上皮细胞失去上皮细胞特征,转变为具有侵袭能力的间充质表型,从而获得迁移行为[6]。研究显示,EMT可作为癌症干预的潜在靶点,并提供了初步抗肿瘤治疗方向[7],但目前关于EMT相关基因评估预后的特征研究较少。基于此,本研究分析EMT相关基因水平在评估肝癌免疫治疗效果方面的应用价值,以便为临床早期干预提供理论支持。

1 资料与方法

1.1一般资料 将2020年1月至2021年1月于新疆维吾尔自治区人民医院行免疫治疗的113例肝癌患者纳入研究,纳入标准:(1)经病理诊断符合原发性肝细胞癌患者;(2)行手术切除治疗者;(3)术后接受免疫治疗者;(4)年龄18～75岁者;(5)预期生存期≥1年者;(6)临床资料完整者。排除标准:(1)合并心、脑、肾等器官严重功能障碍者;(2)合并其他部位恶性肿瘤者;(3)合并自身免疫、血液系统疾病者;(4)对治疗药物过敏或不耐受者;(5)合并严重精神-神经系统功能障碍,不能配合者。所有患者及家属均对本研究知情,并签署知情同意书,本研究通过新疆维吾尔自治区人民医院伦理委员会审核并批准(批号:K20191218294)。经过1年随访,共有6例患者失联,按脱落处理,最终纳入患者107例。

1.2仪器与试剂 仪器:4 ℃离心机、移液枪、微量紫外分光光度仪、酶标仪(主波长450 nm,参考波长630 nm),37 ℃孵育箱等。试剂:Trizol,三氯甲烷,E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)免疫组化试剂等,全部试剂均购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3方法 采用电子病历系统收集患者年龄、性别等一般临床资料。于术中留取生长活跃且无出血、坏死的肿瘤组织,置于-70 ℃内冰箱内保存。采用Trizol一步法提取肝癌组织块中的总RNA,根据逆转录试剂盒说明合成cDNA,取2 μL逆转录产物进行PCR扩增,对患者肝癌组织中Snail及Twist水平进行检测。留取部分肿瘤组织,采用PBS缓冲液清洗2～3遍后加入适量蛋白裂解液,充分研磨后提取组织中的蛋白质,采用酶联免疫吸附试剂盒测定E-cadherin、N-cadherin水平。所有患者术后均给予免疫治疗,并于患者出院后进行为期1年的随访,前3个月每个月于门诊随诊,后每3个月于门诊随诊,在随访终点记录患者是否出现肿瘤复发、转移及死亡等,并根据随访结果将患者分为预后良好组及预后不良组,比较两组患者一般临床资料及EMT相关基因水平,分析EMT相关基因水平在评估患者免疫治疗预后方面的诊断价值。

2 结 果

2.1两组患者一般资料比较 随访结束,预后良好组75例,预后不良组32例。预后不良组患者肿瘤最大径大于预后良好组(t=2.183,P=0.031),而两组患者年龄、性别等一般资料比较,差异无统计学意义(均P>0.05),见表1。

表1 两组患者一般资料比较或n(%)]

2.2EMT相关基因水平比较 预后良好组患者的Snail、Twist及N-cadherin水平低于预后不良组(均P<0.05),E-cadherin水平高于预后不良组(P=0.001),见表2。

表2 EMT相关基因水平比较

2.3影响患者预后危险因素的Cox回归分析 将单因素分析有统计学意义的指标带入Cox回归方程进行分析,结果显示,Snail、Twist及N-cadherin水平是患者免疫治疗效果不佳的独立危险因素,E-cadherin水平则是独立保护因素(均P<0.05),见表3。

表3 影响患者预后危险因素的Cox回归分析

2.4列线图模型及校正曲线 列线图模型显示,随着Snail、Twist、N-cadherin水平升高及E-cadherin水平降低列线图模型评分随之增加,随着列线图模型评分升高,患者免疫治疗预后不良风险升高,见图1。列线图模型预测患者免疫治疗预后不良风险的C-index为0.923(95%CI0.876～0.943),区分度良好,经内部验证,获得校正曲线,结果显示列线图模型预测患者免疫治疗预后不良风险的绝对误差为0.016,一致性良好,见图2。

图1 影响患者免疫治疗效果的相关因素列线图

图2 影响患者免疫治疗效果列线图的校正曲线

2.5影响患者免疫治疗效果不佳因素的预测价值 ROC曲线结果显示,Snail、Twist、E-cadherin、N-cadherin及4项指标联合预测患者免疫治疗效果不佳的曲线下面积(AUC)分别为0.701、0.758、0.651、0.742及0.879,4项指标联合预测效能优于各项指标单独预测(Z=3.402,2.522,3.894,2.987,P<0.05)。见表4。

表4 影响患者免疫治疗效果不佳因素的预测价值

3 讨 论

肝细胞癌是世界范围内恶性程度最高的癌症之一,因其具有高度异质性及高复发、高转移率,导致肝细胞癌患者生存期较短,尽管外科和药物治疗已取得快速进展,但肝细胞癌的死亡率仍居高不下[8]。近年来免疫检查点抑制剂的引入极大地改变了包括肝细胞癌在内的肿瘤治疗方案[9-10]。但低免疫应答率可严重影响免疫治疗疗效,故在免疫治疗前对患者免疫应答情况进行评估,对免疫治疗的选择及方案制订至关重要[11]。随着高通量测序技术和生物信息学的快速发展,越来越多的基因生物标志物被发现是疾病诊断、治疗评估及预后的关键调控因子[12-14]。

EMT在癌细胞转移及耐药性中发挥关键作用,EMT期间,细胞失去细胞-细胞和细胞-细胞外基质的黏附,获得间充质细胞表型,使得细胞从原发肿瘤分离[15],也有研究证实了EMT与肿瘤进展和转移之间的联系[16],EMT参与胚胎发生和恶性肿瘤侵袭、转移,促进恶性肿瘤细胞侵袭并向远处组织扩散,从而促进肿瘤转移,既往研究证实EMT参与了肝细胞癌的进展[17-18]。而癌细胞的转移导致90%以上的癌症相关死亡,在EMT过程中,上皮细胞失去极性并获得侵袭性,成为间充质干细胞[19]。Snail是著名的EMT激活转录因子,在肿瘤核组织、邻近间质和瘤周炎症中高度表达,可直接结合并抑制近端CDH1启动子上的E-cadherin,并重塑细胞间黏附,还可抑制其他上皮标志物,并激活间充质基因。此外,EMT还能重组上皮极性分子,阻碍基底膜形成,从而促进肿瘤细胞侵袭[20]。本研究结果显示,对于免疫治疗预后不良的患者,其体内Snail水平升高,E-cadherin水平降低,提示肝癌可能发生转移或进一步恶化,对免疫治疗应答不良,从而导致患者预后欠佳。

E-cadherin主要表达于上皮细胞,E-cadherin丢失是EMT程序中最基本事件,通过Snail、Twist等EMT诱导转录因子抑制E-cadherin等上皮样细胞标志物表达,同时上调N-cadherin等间质样细胞标志物表达,促进EMT进程,从而促进癌细胞转移[21]。Snail在EMT中作为E-cadherin表达的关键转录抑制因子,赋予肿瘤细胞癌症干细胞样特征,并促进耐药、肿瘤复发和转移[19,22]。既往动物实验显示,Snail表达对小鼠乳腺癌细胞中Zeb1的诱导和转移播散至关重要,而Twist则是其他EMT转录因子表达所必需的,可诱导部分EMT和转移[23]。本研究结果显示,Snail、Twist、N-cadherin为患者免疫治疗预后的独立危险因素,E-cadherin为独立保护因素,提示对于免疫治疗疗效不佳的患者,其肿瘤细胞可能发生EMT改变,而EMT相关基因高表达的患者,对免疫治疗不敏感,预后不良。这与CHANG等[24]对结直肠癌患者的预后分析一致,CHANG等[24]研究表明,E-cadherin低表达与结直肠癌患者的预后不良有关,可用于预测结直肠癌患者预后。此外,MASUDA等[25]对乳腺癌患者血液中的N-cadherin的mRNA水平进行分析,结果显示N-cadherin可作为预测乳腺癌患者转移、复发的新型预后生物标志物。尽管针对上述指标研究的肿瘤患者群体不尽相同,但对肿瘤的预测、分析结果却大同小异,提示Snail、Twist、N-cadherin及E-cadherin在预测肿瘤患者预后、治疗疗效方面具有一致性。

此外,本研究基于上述指标绘制ROC曲线,结果显示,Snail、Twist、N-cadherin及E-cadherin联合预测患者免疫治疗效果不佳的预测效能优于各项指标单独预测,能对患者免疫治疗的疗效进行有效预测,对于免疫应答率低的患者应考虑给予其他干预以改善患者预后。列线图模型结果显示,根据Snail、Twist、N-cadherin及E-cadherin构建的预测模型具有较好的C-index,并与实际发生的相关性较好,经内部验证的校正曲线也表明列线图模型可有效预测患者免疫治疗疗效,具有较好的临床应用价值。

综上所述,免疫治疗疗效不佳的患者其Snail、Twist、N-cadherin水平升高,而E-cadherin水平降低,4项指标联合可有效预测患者对免疫治疗的敏感性。但本研究仍存在一定不足,受限于纳入样本量,导致分析因素较少,且并未对患者进行长期随访,亦未对患者生存期及无进展生存期变化作进一步探究。故应进一步行多中心、大样本、前瞻性临床试验,以便对患者免疫应答情况进行预测,积极给予其他干预,以延长患者生存期,改善患者预后。