蛋白质组学技术在速冻食品中的应用研究进展

黄姗，时文六，白天，纵伟

（1.河南省食品和盐业检验技术研究院，河南 郑州 450000；2.郑州轻工业大学 食品与生物工程学院，河南 郑州 450000）

蛋白质组是指一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质。蛋白质组学是指以蛋白质组为研究对象，从整体的角度，分析细胞内动态变化的蛋白质组成与变化规律的科学[1]。蛋白质组学不仅仅在动物[2]、植物[3]和微生物[4]等生物学科中得到发展，而且在食品工业中得到广泛应用[5-6]。近年来，速冻食品产业在我国得到快速发展，速冻食品加工过程中，通过蛋白质组学方法，了解原料中蛋白质在加工过程中的组成、数量及其功能特性的变化，了解环境中微生物对速冻食品的影响[7-8]，对控制速冻食品的质量和安全具有重要作用。本文对蛋白质组学的基本技术及其在速冻食品中的应用现状进行综述，并对未来的发展进行展望，以期为进一步扩大蛋白质组学在速冻食品中的应用提供参考。

1 蛋白质组学研究过程中的主要技术

1.1 蛋白质提取技术

蛋白质提取首先是进行匀质化，然后采用适宜的溶剂对蛋白质进行溶解提取。目前，蛋白质匀质的方法有机械法、超声法、液氮研磨、热处理和冻融法等[9-10]。如，Kielkopf 等[11]为有效提取大肠杆菌中的蛋白质，采用液氮研磨和超声处理裂解大肠杆菌，有利于后期的提取操作。

对匀质后的蛋白质，需要采用适宜的溶剂体系将其从原料中提取出来。对于理想的提取溶剂体系，不仅要对蛋白质有较强的溶解性，而且要防止被提取的蛋白质变性，提取后要容易去除。目前，常见的蛋白质提取溶剂体系有尿素、十二烷基磺酸钠、三羟甲基氨基甲烷/酚等[12]，如，郭小蛟等[13]分别采用离心-超声波破碎法和液氮研磨-超声波破碎法对浓香型白酒酒醅样品进行预处理后，采用三羟甲基氨基甲烷/酚提取、甲醇/醋酸铵沉淀提取微生物蛋白质，优化了酒醅微生物蛋白质的提取方法。近年来，一些研究者还在探索新的溶剂提取体系，如，Rufino 等[14]以离子液体形成双水相，萃取分离牛血清白蛋白，并优化了提取条件，在最优条件下，牛血清白蛋白的回收率和纯度较高，且原有的二级结构在提取过程中未破坏。与有机溶剂相比，离子液体具有熔点低、化学稳定性高、溶解能力强、结构可调等特性，因此，蛋白质提取的离子液体溶剂体系的研究，仍是未来的研究热点。

1.2 蛋白质分离技术

提取后的蛋白质，由于其中含有大量杂质，需要进行进一步分离纯化，目前常用的方法有双向凝胶电泳、双向荧光差异电泳、毛细管电泳和高效液相色谱等方法。

双向凝胶电泳基于等电点的差异进行等电聚焦电泳分离，再根据蛋白质分子质量的差异，在垂直方向进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）二次分离，该方法分离效果好、重复性强。如，Sandhya 等[15]为分析苔藓中蛋白质组成，采用三羟甲基氨基甲烷-盐酸提取、三氯乙酸-丙酮沉淀的方法得到粗蛋白质，然后采用双向凝胶电泳进行分离，苔藓蛋白得到有效分离。双向凝胶电泳分离效果好，但其无法实现自动化连续分离。

毛细管电泳是通过在高电场强度下，对毛细管中的待测蛋白进行分离的方法，根据分离原理不同，可分为毛细管区带电泳、毛细管等电聚焦和SDS-毛细管电泳等。如，Omar 等[16]对欧洲单峰骆驼乳中的蛋白[α-乳清蛋白（α-lactalbumin，α-Lac）、乳铁蛋白（lactoferrin，Lf）、β-酪蛋白（β-casein，β-CN）和α-酪蛋白（α-casein，α-CN）]进行分离，发现毛细管电泳可实现有效分离。

对于分子量小、丰度低、成分复杂的蛋白质，双向凝胶电泳和毛细管电泳分离都存在一定的困难，高效液相色谱对该类蛋白质具有较好的分离效果，已成蛋白质组学研究的主要手段。如，成希飞等[17]采用反相高效液相色谱对广东水牛乳乳清蛋白成分进行了分离和定量分析研究，研究发现采用反相高效液相色谱可将乳清蛋白中α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-La）、β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）3 种主要成分有效分离。

由于目前单一的分离方法都存在一定的局限性，因此，根据蛋白质物理、化学和生物学特性的差异，将多种分离方法集成应用，在保持蛋白质生物学特性的基础上，对蛋白质高效分离的方法将是研究者关注的热点。

1.3 蛋白质鉴定技术

目前，蛋白质的鉴定技术包括传统的蛋白质鉴定技术[18]、肽质量指纹谱蛋白质鉴定技术[19]、蛋白芯片[20]和质谱技术（mass spectrum，MS）[21]等。

传统的蛋白质鉴定技术主要采用Edman 降解法和氨基酸成分分析法。Edman 降解法时间长、费用高，氨基酸成分分析法速度慢、需要样品数量大；肽质量指纹谱蛋白质鉴定技术根据样品水解后的肽段形成的反映肽段序列、肽混合物质量数的指纹图谱，在蛋白质数据库中进行检索、匹配、分析。但由于在制备或加工过程中，样品会与所用化学试剂产生修饰反应，会导致匹配存在一定的误差；蛋白芯片是将一个蛋白质家族所有成员或者一种蛋白质的所有变异体固定在特定固相载体的表面，形成一种蛋白识别分子（抗体）或蛋白样品的微阵列传感片，该法灵敏度高、特异性强，适用于大通量的蛋白质筛选。质谱技术是将蛋白质、多肽样品进行分子离子化后，通过测定不同离子的质荷比来确定相对分子质量，并通过分析碎片离子，获得氨基酸序列和翻译后修饰物。如，宋天园等[22]采用高效液相色谱复合四极杆轨道阱质谱法对柏树花粉中的主要过敏原蛋白进行分析和鉴定，应用溶剂法提取圆柏花粉中的蛋白，经酶切、前处理和色谱分离后，采用复合四极杆轨道阱质谱对蛋白进行分析，检测出37 种蛋白，获得花粉中丰富的蛋白和肽段信息，该方法具有较高的灵敏度和分辨率；金萍等[23]在对大闸蟹蛋白提取方案、质谱参数优化的基础上，采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法建立了阳澄湖大闸蟹组织蛋白分子指纹图谱，为产地鉴别分析建立了条件。MS 法准确、特异、灵敏、高通量，是目前蛋白质组学鉴定最有效的方法。

1.4 生物信息学分析技术

采用凝胶双向电泳、蛋白芯片和质谱等手段获得大量蛋白、多肽的数据后，目前形成了一些蛋白质组数据库，如SWISS-PROT 、WORLD-2D PAGE 等。这些蛋白质组数据库包含需要鉴定的蛋白质信息，如结构[蛋白质的顺序、核苷酸顺序、二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2DPAGE）、三维聚丙烯酰胺凝胶电泳（three-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，3D-PAGE）]、翻译后的修饰、基因组及代谢数据库等。需要对这些数据进行生物信息学分析，目前蛋白质组学进行的生物信息学分析主要是基因本体分析[24]、京都基因分析[25]、基因组百科全书分析[26]、聚类分析和蛋白互作分析[27]。但由于这些数据复杂、高通量，要进入数据库进行检索，需要由相关的软件对数据进行处理，目前，一些新的软件不断得到开发。如对2D-PAGE 进行斑点检查与量化、背景过滤、图像匹配与比较及统计分析的软件，对蛋白质结构信息进行比对和结构预测的软件，如SEQUEST、MS-Fit 和Findmod 等[28]。这些软件的应用，都是蛋白质信息分析的重要手段。今后，生物信息学数据库的建立和应用软件的开发仍将得到持续关注，将蛋白质鉴定和生物信息学分析相结合，建立高通量、大规模、自动化的鉴定复杂蛋白质样品的方法，如何实现快速、准确地筛选功能蛋白质是研究者关注的热点。

2 蛋白质组学技术在速冻食品中的应用

2.1 在速冻食品原料种类鉴别中的应用

速冻食品的品质与其原料的品质密切相关[29]，因此，速冻食品的原料种类鉴别对控制原料质量具有重要作用。Buckley 等[30]采用固相萃取方法对不同品种的羊肉中的多肽进行纯化，采用基质辅助激光解吸附串联质谱技术（matrix assisted laser desorption ionization，MALDI-MS/MS） 对来自绵羊和山羊胶原蛋白的33 种氨基酸进行多肽测序后发现，绵羊和山羊两个物种之间存在2 条氨基酸序列的差异，可用于区分喜马拉雅塔尔羊与羱羊等不同品种；鱼类是速冻鱼丸、鱼排等产品的主要原料，张九凯等[31]对大西洋鲑、大马哈鱼和虹鳟中的蛋白质进行提取、胰蛋白酶消化后，采用超高效液相色谱-串联三重四极杆飞行时间质谱法进行分离鉴定，通过与Uni Prot 蛋白质数据库对比分析，筛选得到这3 个物种的7 条特征肽段，为3 种鱼类的品种鉴别建立了有效的方法。牛肉的原料特性对相应的速冻食品产生重大影响，通过蛋白质组学研究，牛肉中的一些特定蛋白质组分与牛肉的水分流失、色泽、弹性等品质密切相关。Myosin（MY）是在牛肉中存在的一个蛋白质家族，其包括MY1、MY2、MYPF 和MY6B 等，MY 在牛肉的品质控制中起到重要的作用[32]。De Souza Rodrigues 等[33]通过蛋白质组学分析了内罗毕（Nellore）和安格拉（Angus）牛的腰部肌肉，发现内罗毕牛的腰部肌肉中蛋白组分MY 的轻链部分MYL1 含量显著高于安格拉牛，这是两种牛肉具有不同品质的重要原因。同一类的食品原料，由于产地、季节、种（养）植时间等因素不同，原料的品质会产生一定的差异。今后，采用蛋白质组学研究产地、季节、种植（养殖）时间等对原料品质的影响将是研究者关注的热点。

2.2 在速冻食品原料掺假鉴别中的应用

在速冻食品生产过程中，掺假成为消费者关心的热点问题，如速冻羊肉卷中添加鸭肉、速冻牛肉丸中添加猪肉等。因此，食品科学工作者一直在研究速冻食品原料掺假的检测方法[34]。但传统的感官、形态、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）等方法很难实现鉴别。近年来，研究者开发了蛋白质组学、聚合酶链式反应和光谱分析等技术[35]，其中蛋白质组学技术受到关注。如，Montowska 等[36]将山羊肉、绵羊肉等原料混合成为16 种肉糜，采用2D-PAGE 和非胶分级分离电泳结合MS 技术，从肌球蛋白轻链MLC1 和MLC2 中获得了特异性的肽段，由此可实现检测不同肉类中的掺假量；蒲科源等[37]为构建高通量、快速、经济的牛肉掺假鉴别方法，采用生的和熟的牛、鸡、鸭、猪4 种肉进行蛋白质提取，采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱采集得到离子峰，采用随机森林算法得到11 个区分不同肉的特征蛋白质，结合主成分分析和数据可视化方法，构建了牛肉掺假鉴别模型；Stachniuk 等[38]为鉴别猪肉、鸡肉和羊肉掺假兔肉，采用液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight-mass spectrometry-mass spectrometry，LC-QTOF-MS/MS）方法对纯兔肉及含有5%～85%的兔肉与其他常见的肉类（猪肉、鸡肉和羊肉）的混合样进行分析，从肌原纤维蛋白和肌浆蛋白中鉴定了49 种特异性多肽，鉴别肉类是否含有兔肉成分。Yuswan 等[39]采用化学计量学辅助鸟枪蛋白质组学对猪肉、牛肉和鸡肉进行肽标记，通过肽质量指纹图谱（peptide mass fingerprinting，PMF）分析鉴定肽标记，采用伪装、随机和串联的数据库搜索程序MS-Fit 和MS-Tag 进行分析，区分相应的肉的比例。

目前，肉类原料掺假主要是采用凝胶电泳结合质谱技术进行鉴别，但该类方法还存在一定的局限性，一是采用凝胶进行蛋白（多肽）分离时，蛋白（多肽）的分子量要适宜，过大或过小都不易分离，二是在蛋白（多肽）中明确特异性标记蛋白（多肽）难度较大[39]。如何克服这两方面的缺陷，是今后原料掺假鉴别中亟需解决的问题。

2.3 在速冻食品微生物安全控制中的应用

微生物的分布和数量对速冻食品的安全具有重要影响，一些微生物在低温冷冻、高温、高压等极端条件下，能够针对外界条件进行响应，导致其蛋白质产生相应的响应，因此，采用蛋白质组学技术可了解其微生物的变化情况。如，Mihoub 等[40]研究了冷冻条件下两种大肠埃希氏菌I2 与R3 的生存情况，采用2DPAGE 分离出不同冷冻条件下微生物细胞质和外膜上的蛋白，并且利用质谱进行鉴定，发现I2 与R3 对冷冻的耐受能力不同，R3 具有更好的冷冻耐受能力，冷适应导致了某些蛋白质表达的变化，在R3 菌株中发现延长因子EF-TU 在外细胞膜上的过度表达，鞭毛素蛋白FLIC 在细胞质中表达量下降；赵晓策等[41]采用表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术分析冷鲜滩羊肉贮藏中微生物菌体蛋白质及变化规律，采用气相色谱-飞行时间质谱联用仪分析其代谢产物及变化规律，采用主成分分析法及热力图分析法对菌体蛋白质差异与代谢产物之间的关联性进行分析，发现滩羊肉在贮藏过程中微生物的菌体蛋白质变化对代谢通路产生影响，导致形成不同代谢产物；Fuertes-Perez 等[42]在肉类模拟培养基中，监测不同气体对肉食发光杆菌和磷酸假单胞菌生长的影响，并在指数增长期间采集样本进行蛋白质组学分析。发现发光细菌不感知环境中二氧化碳的水平，而是适应自身的厌氧代谢。在厌氧条件下，二氧化碳对发光细菌生长的调节是有限的，并且只对特定菌株有效；Zhao 等[43]将蛋白质组学与代谢组学相结合，用于猪肉分泌物的新鲜度研究，测定了不同温度（25、10、4、-2 ℃）下储藏的猪肉分泌物中肽类和代谢产物的变化，鉴定了来自7 种蛋白质和30 种代谢产物的肽，发现它们在新鲜猪肉和变质猪肉之间的丰度不同。猪肉品质与这7 种蛋白和30 种代谢产物的多肽之间存在显著相关性，并提出这种变化可作为判断猪肉是否腐败变质的标志。

由于速冻食品的安全性是消费者关注的热点，利用蛋白质组学控制速冻食品的微生物安全仍是今后的热点问题。

2.4 在速冻食品品质控制中的应用

速冻食品加工过程中，不同的加工条件会导致蛋白质发生变化，利用蛋白质组学技术挖掘表征原料品质的生物标志物，研究在加工过程中这些标志物的变化，成为速冻食品加工领域中的研究热点。

速冻食品反复冻融会对产品的质构和风味产生较大的影响，为了解鲜肉和冻融肉蛋白质之间的差异，Kim 等[44]采用双向凝胶电泳结合质谱对鲜肉和冻融肉的渗出物进行检测，发现鲜肉和冻融肉的蛋白质表达有差异，发现有22 种蛋白质可用于区分鲜肉和冻融肉；热休克蛋白是在动物中广泛存在的一类高度保守蛋白家族，其中的Hsp27 和Hsp70 表达量与肉品质量密切相关，马惠敏等[45]研究托盘、真空、高氧气调和低氧气调包装等不同包装方式对羊肉冷藏过程中Hsp27 和Hsp70 表达量的影响，并且测定冷藏过程中羊肉品质指标（pH 值、色泽、剪切力和蒸煮损失）的变化，发现Hsp27、Hsp70 与品质指标之间有显著相关性，可作为羊肉加工过程中品质指标控制的生物标志物；He 等[46]研究罗非鱼尸体贮藏过程中蛋白质组的变化，在贮存（冰藏0、7 d）后对罗非鱼骨骼肌蛋白质组进行鉴定，共鉴定出902 个蛋白质，其中34 个蛋白质发生了显著变化。选择两种差异丰富的蛋白质pgml 和ldha，用贮存0、7 d 的冰冻鱼肉进行进一步验证。发现冰藏罗非鱼鱼片的ldha 和pgm1 蛋白含量显著低于新鲜罗非鱼鱼片，表明肉类嫩度与酶和厌氧条件引起的结构蛋白质降解和乳酸水平增加有关，为进一步研究新鲜和冰储鱼类之间鱼肉质地和肉类嫩度差异的分子机制提供了重要基础；Jia 等[47]采用蛋白质组学分析方法，对水煮、蒸和烘烤对山羊肉结构的影响进行研究，在对照样、水煮样、蒸煮样和烘烤样中分别鉴定出551、84、72、121 种蛋白质。感官评价和蛋白质组学分析结果表明，蒸煮处理对山羊肉的嫩度没有显著影响，而烘烤处理显著降低了山羊肉的嫩度，表明目前保证山羊肉嫩度的有效热处理方法是蒸煮处理。

近年来，一些食品加工新技术，如超高压技术[48]、等离子体技术[49]、超声处理技术[50]等在速冻食品加工中得到应用，利用蛋白质组学研究这些新技术在加工过程中的蛋白质变化，是研究者将密切关注的问题。

3 结论及展望

随着蛋白质组学技术在速冻食品加工中的广泛应用，蛋白质组技术将成为速冻食品加工研究的一个高通量、高灵敏度、高准确性的研究平台，该技术将更加完善和成熟。今后，蛋白质组学在速冻食品原料选择、品质评价、加工过程优化和安全控制领域将得到更广泛的应用。但是，速冻食品加工是一个集原料学、工艺学和生物化学等多学科的跨学科产业，蛋白质组学要在速冻食品加工中得到更好的应用，需要多学科交叉融合、密切协作。此外，单靠蛋白质组学技术研究速冻食品加工发挥的性能有限，需要将蛋白质组学和基因组学、转录组学、代谢组学联合、协同分析，在速冻食品生产领域发挥更好的作用。综上，蛋白质组学技术将在速冻食品领域拥有广阔的发展前景。