链霉菌FJS31-2 abxR2基因克隆表达及蛋白纯化

李泽鑫,王兰林,栗午娟,杨 逸,张悦萌,高佩舒,田红英,岳昌武

(延安大学基础医学院 延安市微生物药物创新及转化重点实验室,陕西 延安 716000)

放线菌是一类革兰氏阳性细菌,与人类生产生活密切相关,抗生素大部分是由放线菌产生的[1-4]。链霉菌(Streptomycessp.)FJS31-2属于放线菌,其基因组全长约11.6 Mb。作者所在课题组[5]从链霉菌FJS31-2发酵产物中发现了卤化PKS Ⅱ型聚酮类新型抗生素Zunyimycins。Zunyimycins具有很高的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性[6],临床应用潜力巨大;同其它多组分抗生素一样,Zunyimycins的多组分生物合成也可能受到复杂严格的调控。比较不同来源的产Zunyimycins或其结构类似物菌株的abx基因簇,发现它们成对存在的调控蛋白AbxR1和AbxR2的编码基因高度保守且读框方向一致(氨基酸同源性高达90%)。GenBank数据库在线同源比对分析发现调控基因abxR2可能编码AfsR/SARP(Streptomycesantibiotic regulatory protein)家族调控蛋白,而SARP家族调控因子通常通过直接激活链霉菌来源天然活性产物的合成基因簇或其它调控基因来发挥其功能[7]。如Yin等[8]在龟裂链霉菌(S.rimosus)中过表达簇内调控基因otcR,使得土霉素产量大大提高;Chen等[9]在杀真菌素链霉菌(Streptomycesfungicidicus)中过表达调控基因orf22,使得恩拉霉素产量得以提高。表明调控基因abxR2可能参与了Zunyimycins的正向调控。因此,作者对调控基因abxR2进行扩增后克隆至pET32a质粒上构建重组质粒pET32a-abxR2[10],利用IPTG诱导表达得到AbxR2重组蛋白,并对其进行纯化,以期为研究AbxR2重组蛋白及提高Zunyimycins产量提供新策略,促进Zunyimycins的进一步开发和转化[11-12]。

1 实验

1.1 材料与试剂

链霉菌(Streptomycessp.)FJS31-2,从贵州省梵净山10～20 cm深地表土壤中分离得到,保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心(菌保号:CGMCC 4.7321)[13];pET32a表达质粒、大肠埃希菌(Escherichiacoli)Rosetta(DE3)感受态细胞,博迈德(北京)基因技术有限公司。

限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ,Thermo Fisher Scientific公司;DNA凝胶纯化回收试剂盒、高纯度质粒小提试剂盒,博迈德(北京)基因技术有限公司;IPTG、Tris、Glycine、SDS、酵母粉、氯化钠、琼脂粉,北京索莱宝科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成

参照GenBank数据库中链霉菌FJS31-2的abxR2基因序列,应用Primer 5.0软件设计abxR2的引物:上游引物:5′-GATAGAGTCCGCAAGGGGCT-3′;下游引物:5′-CGAAAGAGGGGCGAACGACCA-3′,扩增片段长度1 911 bp。引物合成及测序由博迈德(北京)基因技术有限公司完成。

1.2.2 目的基因的扩增与测序

以链霉菌FJS31-2基因组为模板,扩增目的基因。PCR反应条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸1.5 min,共30个循环;72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测,使用DNA凝胶纯化回收试剂盒对PCR产物进行回收纯化。abxR2基因测序由博迈德(北京) 基因技术有限公司完成。

根据测序结果,使用NCBI数据库中Blast程序对abxR2基因的蛋白质氨基酸序列进行序列同源性比对,从GenBank数据库中得到与abxR2同源性较高且已证明具有生物活性功能的调控基因蛋白质氨基酸序列,采用MEGA 5.1软件进行聚类分析,构建系统发育树[14-15]。

1.2.3 重组质粒pET32a-abxR2的构建与鉴定

使用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切pET32a质粒,回收纯化目的片段。将扩增的abxR2片段通过T4 DNA连接酶连接至pET32a质粒上,构建重组质粒pET32a-abxR2,并进行酶切鉴定,送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.2.4 AbxR2重组蛋白的诱导表达

将序列测定正确的重组质粒pET32a-abxR2转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,随机挑取单个菌落至2 mL LB液体培养基(含50 mg·L-1氨苄霉素)中,37 ℃、150 r·min-1培养过夜,然后移至15 mL含氨苄霉素的LB液体培养基中扩大培养;待菌液OD600值为0.6～0.8,按1∶1000的比例加入1.0 mmol·L-1IPTG,28 ℃、110 r·min-1诱导4 h;取诱导后的菌液1 mL,于12 000 r·min-1离心2 min;收集菌体,用500 μL高纯度质粒小提试剂盒P1溶液(25 mmol·L-1Tris-HCl,10 mmol·L-1EDTA,50 mmol·L-1glucose)洗涤,加入30 μL 5×loading buffer混匀,95 ℃煮沸10 min,2 000 r·min-1离心2 min,以10%的分离胶进行SDS-PAGE电泳分析。

1.2.5 AbxR2重组蛋白的纯化

将诱导后的菌液用500 μL的P1溶液洗涤2次后,再用其重悬菌体,300 W超声(工作4 s,间歇4 s,共15 min)裂解;将超声破碎后的菌液离心,分别收集上清和沉淀;向上清中加入2倍体积的冰丙酮溶液(-20 ℃预冷);因为目的蛋白以包涵体形式在大肠埃希菌中表达,收集包涵体沉淀,进行AbxR2蛋白纯化:先依次用1 mol·L-1、2 mol·L-1、4 mol·L-1尿素溶液洗涤包涵体,去除其中部分杂质;然后用8 mol·L-1尿素溶解包涵体,得到较为粗制的包涵体;再采用逐步稀释复性法对粗制包涵体进行复性,向溶液中缓慢加入1 mol·L-1低浓度尿素至溶液中尿素浓度降至1.5 mol·L-1,使得包涵体恢复至正确的空间结构。

2 结果与讨论

2.1 关键基因系统进化分析

对abxR2基因扩增得到1 911 bp的PCR产物,测序正确后,使用NCBI数据库中的Blast程序进行序列同源性比对,结果如图1所示。

图1 链霉菌FJS31-2 AbxR2与其它菌株调控因子基因系统进化分析

从图1可以看出,链霉菌FJS31-2 AbxR2的氨基酸序列与链霉菌属Streptomycesrimosussubsp.rimosusOtcR的同源性为41%、与StreptomycestsukubensisFkbN的同源性为38%、与StreptomycesnatalensisPimR的同源性为36%,与StreptomycescoelicolorA3(2)redD的同源性为34%、与StreptomycesfilamentosusDptR2的同源性为44%,与Streptomycessp.Tu 4128BagⅠ的同源性为33%。

2.2 重组质粒pET32a-abxR2的构建与鉴定

将ZunyimycinsabxR2基因片段通过T4 DNA连接酶连接至pET32a质粒上,获得重组质粒pET32a-abxR2。然后对pET32a-abxR2进行NcoⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定,发现abxR2基因片段成功克隆到pET32a质粒上(图2)。

M.10000 bp DNA marker 1.质粒DNA 2.pET32a-abxR2双酶切片段

2.3 AbxR2重组蛋白的诱导表达

28 ℃下,用1.0 mmol·L-1IPTG诱导AbxR2重组蛋白表达,诱导后的菌液经超声处理后,离心,收集沉淀,进行SDS-PAGE电泳检测,结果如图3所示。

M.标准蛋白marker 1.未诱导表达 2,3.IPTG诱导表达(28 ℃、110 r·min-1、菌液OD600值为0.6、1.0 mmol·L-1IPTG诱导4 h)

从图3可以看出,表达的AbxR2蛋白为包涵体蛋白,在约100 kDa处出现目的条带,与预期蛋白大小一致。因此,确定最优诱导条件为:菌液OD600值为0.6时,用1.0 mmol·L-1IPTG于28 ℃、110 r·min-1诱导4 h。

2.4 AbxR2重组蛋白的纯化

首先在低温下,依次用1 mol·L-1、2 mol·L-1、4 mol·L-1尿素溶液洗涤AbxR2重组蛋白包涵体,通过逐步稀释复性法对包涵体进行复性,降低尿素浓度,使蛋白正确折叠,达到纯化目的。其SDS-PAGE电泳图谱如图4所示。

M.标准蛋白marker 1.未诱导表达的AbxR2重组蛋白包涵体2～5.IPTG诱导表达(28 ℃、110 r·min-1、菌液OD600值为0.6、1.0 mmol·L-1IPTG诱导4 h)的AbxR2重组蛋白包涵体

从图4可以看出,在100 kDa处出现了1条与预测大小一致的特异蛋白条带。

2.5 讨论

进一步分别对调控蛋白AbxR1、AbxR2的功能域进行分析发现,AbxR2的N末端相对保守,具有AfsR调控蛋白家族常见的HTH、BTAD、NB-ARC等保守功能域,但和放线菌来源的、不负责调控Zunyimycins类似物合成的AfsR蛋白相比,其C末端和地细菌类群(Terrabacteriagroup)相似,C末端自603个氨基酸残基处缺失,没有TPR功能域。由于TPR功能域介导了蛋白质之间的相互作用,这意味着Zunyimycins生物合成基因簇的调控模式可能不同于传统的放线菌AfsR调控。提示Zunyimycins的生物合成调控可能有其独特之处,可进行深入研究。

由于大肠杆菌生长快、表达量高,容易培养,是原核表达系统高效表达的优选,因此,本研究在成功构建了重组质粒pET32a-abxR2后,选择大肠埃希菌Rosetta(DE3)作为表达宿主菌[16-17]进行IPTG诱导表达,发现在菌液OD600值为0.6时,用1.0 mmol·L-1IPTG于28 ℃、110 r·min-1诱导4 h,AbxR2重组蛋白的表达效果较好[18]。

通过SDS-PAGE分析,确定AbxR2蛋白以包涵体形式存在,并对包涵体进行纯化。为研究AbxR2蛋白、培育Zunyimycins高产菌株提供了理论依据和物质基础。

3 结论

利用原核表达系统获得链霉菌FJS31-2 AbxR2重组蛋白,并进行蛋白纯化。通过PCR扩增abxR2基因,将扩增产物克隆至pET32a质粒上,构建重组质粒pET32a-abxR2;将重组质粒转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,在菌液OD600值为0.6时,用1.0 mmol·L-1IPTG于28 ℃、110 r·min-1诱导4 h,AbxR2重组蛋白的表达效果较好;采用尿素洗涤方式纯化AbxR2重组蛋白,得到单一特异蛋白条带。为研究AbxR2蛋白的结构和功能及提高Zunyimycins产量奠定了基础。