磁性凝胶包埋固定仲醇脱氢酶研究

朱益慧,李大力

(南京理工大学生物工程系,江苏 南京 210094)

酶作为重要的生物催化剂参与许多生物过程,由于其高特异性和高效率,已应用于化工[1-2]、食品[3-4]和生物医学[5-6]等领域。游离酶因稳定性低和难回收在应用中受到限制[7],而固定化酶弥补了游离酶缺陷,应用领域不断拓宽[8-9]。酶固定化方法可分为物理法和化学法[10]。前者主要包括吸附和包埋,后者主要为共价连接和交联。凝胶是一种亲水交联聚合物,很多研究者用凝胶来制备固定化酶。如Brahim等[11]将葡萄糖氧化酶固定在p(HEMA)-凝胶中,研究了其在填料床生物反应器中的动力学性质;卢钒[12]将海藻酸钠凝胶微球包埋酶用于尿酸/葡萄糖的即时检测;刘再冉[13]将漆酶和磁性生物炭共同包埋在聚乙二醇双丙烯酸酯和聚乙二醇双马来酸单酯凝胶中用于高效去除水中偶氮染料;Zhao等[14]利用大孔聚丙烯酰胺凝胶固定辣根过氧化物酶。磁性凝胶固定化酶是指在交联的亲水性聚合物三维网络中包埋磁性颗粒和酶,凝胶的磁性使其更易于从反应体系中回收,磁性凝胶固定化酶在生物催化工程中具有一定应用价值。

仲醇脱氢酶是一种氧化还原酶,作者所在课题组[15-16]在前期研究中提取获得了一种依赖NAD+、以R-苯乙醇为底物的仲醇脱氢酶(PEDH),并将葡萄糖脱氢酶与此酶偶联实现了R-苯乙醇的合成。作者在此用磁性凝胶包埋固定仲醇脱氢酶用于催化手性R-乙醇基吡啶的合成,通过扫描电子显微镜(SEM)和振动样品磁强计(VSM)分别对其形貌和磁性进行表征,并对其酶学性质进行研究。

1 实验

1.1 试剂

磁性四氧化三铁颗粒、丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、聚乙烯亚胺(PEI,分子量600),阿拉丁实业有限公司(中国上海);4-乙酰基吡啶,希恩思生化公司(中国天津);NADH,阿拉丁生物科技有限公司(中国上海);仲醇脱氢酶(PEDH),自行提取获得[15]。

1.2 磁性凝胶包埋固定化仲醇脱氢酶的制备

在小烧杯中加入30%丙烯酰胺600 μL、5%聚乙烯亚胺250 μL、5%四氧化三铁悬浮液1.05 mL、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺20 μL、1%过硫酸铵80 μL、仲醇脱氢酶液1 mL,搅拌均匀后按照每孔100 μL的量迅速添加到96孔板中;待凝胶形成后取出,在水中浸泡10 min去除未交联的丙烯酰胺单体,洗净,即得磁性凝胶包埋固定化仲醇脱氢酶(Gel-Fe3O4/PEI@PEDH,以下简称固定化酶),置于4 ℃冰箱中保存备用。

同法制备不含酶、磁性颗粒、聚乙烯亚胺的纯凝胶(Gel);不含酶、聚乙烯亚胺的磁性凝胶(Gel-Fe3O4);不含酶但掺入聚乙烯亚胺的磁性凝胶(Gel-Fe3O4/PEI)。

1.3 酶活测定

取2.7 mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(50 mmol·L-1,pH值7.0)和100 μL 4-乙酰基吡啶(50 mmol·L-1),混合,于25 ℃预热3 min,加入50 μL待测酶液和50 μL辅酶NADH(5 mmol·L-1),45 ℃反应5 min,测定340 nm处吸光度。用等量去离子水代替待测酶液作为对照组,根据吸光度的变化计算NADH反应后的减少量。已知340 nm处NADH的摩尔吸光系数(ε)为6.22 L·mmol-1·cm-1。

酶活定义为:在最适反应条件下,每分钟消耗1 μmol NADH所用的酶量作为一个酶活单位(U)。

1.4 酶的最适反应pH值和最适反应温度筛选

25 ℃下,当磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(50 mmol·L-1)pH值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0时,按1.3方法测定游离酶和固定化酶的活性,其中游离酶反应5 min,固定化酶反应20 min。以最高活性为100%计算相对活性,确定固定化酶的最适反应pH值。

同法,在磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(50 mmol·L-1)pH值为7.0,反应温度分别为25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃时,测定游离酶和固定化酶的活性,确定固定化酶的最适反应温度。

1.5 酶促反应动力学参数测定

采用双倒数作图法测定游离酶和固定化酶对4-乙酰基吡啶的酶促反应动力学参数,包括米氏常数(Km)和最大反应速度(Vmax)。

1.6 酶的稳定性研究

将酶分别在不同温度(4 ℃、45 ℃、70 ℃)下静置3 h,每隔1 h取样,在最适反应条件下测定残留活性(以初始活性的百分比计,初始活性为100%),考察酶的热稳定性。将酶分别在不同pH值(5.0、7.0、8.0)的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(50 mmol·L-1)中静置3 d,每隔24 h取样,在最适反应条件下测定残留活性,考察酶的酸碱稳定性。

1.7 固定化酶的重复使用性能研究

在最佳反应条件下,将固定化酶用于催化R-乙醇基吡啶的合成,20 min后取出,测定残留活性;用去离子水冲洗3次后重复使用,测定残留活性,重复使用5次,考察固定化酶的重复使用性能。

2 结果与讨论

2.1 固定化酶的形貌

Gel、Gel-Fe3O4、Gel-Fe3O4/PEI、Gel-Fe3O4/PEI@PEDH的SEM照片如图1所示。

图1 Gel(a)、Gel-Fe3O4(b)、Gel-Fe3O4/PEI(c)、Gel-Fe3O4/PEI@PEDH(d)的SEM照片

由图1可以看出,Gel表面较光滑(图1a);加入Fe3O4后,可以看到磁性凝胶Gel-Fe3O4包埋的Fe3O4纳米颗粒团簇(图1b),这是Fe3O4颗粒聚集导致的[17];加入Fe3O4、PEI后,磁性凝胶Gel-Fe3O4/PEI包埋的Fe3O4纳米颗粒的表面形态没有变化(图1c);当仲醇脱氢酶被包埋进凝胶后,凝胶结构没有被破坏(图1d)。实验发现,制备的Gel富有弹性,机械性能良好;而聚乙烯亚胺是一种水溶性高分子聚合物,可以静电吸附带负电荷的NAD+和NADH,在凝胶制备过程中掺入聚乙烯亚胺有利于NAD+和NADH在凝胶中富集,提高固定化酶的催化效率。

2.2 固定化酶的磁性

为改善传质效果,凝胶包埋固定化酶在使用时通常需剪切成小块,但若凝胶过于细小时,会增加固定化酶的回收难度。因此,将磁性颗粒与酶共同包埋在凝胶中,以便使用外加磁场实现固定化酶的回收。

Fe3O4和Gel-Fe3O4/PEI@PEDH的磁性分析结果如图2所示。

图2 Fe3O4和Gel-Fe3O4/PEI@PEDH的磁性分析结果

由图2可知,Fe3O4磁性颗粒的饱和磁化强度为76.85 emu·g-1;用凝胶包埋后,Gel-Fe3O4/PEI@PEDH磁性凝胶的饱和磁化强度降至6.56 emu·g-1,但仍然可以利用外加磁场自反应体系回收。

2.3 固定化酶的最适反应pH值和最适反应温度

反应pH值和反应温度对游离酶和固定化酶的活性影响如图3所示。

图3 反应pH值(a)和反应温度(b)对游离酶和固定化酶的活性影响

由图3a可知,游离酶的最适反应pH值为6.0,固定化酶的最适反应pH值为7.0;与游离酶相比,固定化酶在偏碱性环境能保持较高的活性。由图3b可知,游离酶在25～65 ℃范围内具有较高活性;固定化酶的活性则随着温度的升高先升高后降低,在45 ℃时的相对活性最高,65 ℃时相对活性急速下降。

2.4 酶促反应动力学参数

游离酶和固定化酶利用辅酶NADH还原4-乙酰基吡啶生成4-乙醇基吡啶的反应动力学符合米氏方程。采用双倒数作图法计算得到游离酶对底物4-乙酰基吡啶的米氏常数Km为0.110 mmol·L-1、最大反应速率Vmax为26.178 μmol·L-1·min-1;固定化酶对底物4-乙酰基吡啶的米氏常数Km为0.156 mmol·L-1、最大反应速率Vmax为1.523 μmol·L-1·min-1,远低于游离酶,其原因可能是反应中的传质限制。

2.5 固定化酶的热稳定性

酶的热稳定性是评价酶工业应用价值的重要因素。游离酶和固定化酶在4 ℃、45 ℃、70 ℃下分别静置1 h、2 h、3 h的残留活性如图4所示。

图4 游离酶和固定化酶的热稳定性

由图4可知,固定化酶在4 ℃和45 ℃下静置3 h时,活性几乎没有变化,残留活性在90%左右,在70 ℃静置3 h后的残留活性在40%左右;而游离酶在70 ℃静置1 h就丧失全部活性。因此,将仲醇脱氢酶包埋固定在磁性凝胶中可以增强其热稳定性。

2.6 固定化酶的酸碱稳定性

游离酶和固定化酶在不同pH值(5.0、7.0、8.0)的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(50 mmol·L-1)中静置3 d的残留活性如图5所示。

图5 游离酶和固定化酶的酸碱稳定性

由图5可知,游离酶和固定化酶在pH值为7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中静置3 d后均能保持高活性,具有较高的酸碱稳定性。

2.7 固定化酶的重复使用性能

酶的可重复使用性在工业应用中起着重要作用,良好的重复使用性能可极大降低生产成本。固定化酶重复使用5次后的残留活性如图6所示。

图6 固定化酶的重复使用性能

由图6可知,固定化酶重复使用5次后的残留活性为41%。可能是因为重复反应、重复清洗使得酶泄露和酶蛋白变性,从而导致酶活性降低。

3 结论

通过原位共聚法制备了磁性凝胶包埋固定化仲醇脱氢酶,用于催化手性R-乙醇基吡啶的合成。结果表明,与游离仲醇脱氢酶相比,固定化仲醇脱氢酶的最适反应温度为45 ℃,最适反应pH值为7.0,且具有较高的热稳定性和酸碱稳定性;由于具有磁性,固定化仲醇脱氢酶易于回收,重复使用性能良好,重复使用5次后的残留活性达到41%。