指纹图谱结合网络药理学及分子对接的黑顺片质量标志物预测
2023-12-20屈凌芸宫静雯张玮烨毛春芹郭志俊陆兔林
屈凌芸 薛 蓉 宫静雯 张玮烨 季 徳 毛春芹 郭志俊 高 波 胡 雨 陆兔林
(1 南京中医药大学药学院,南京,210023; 2 华润三九医药股份有限公司,深圳,518110; 3 安徽华润金蟾药业股份有限公司,淮北,235000)
附子为毛茛科植物乌头AconitumcarmichaeliiDebx.的子根加工品,具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛的功效[1]。附子有大毒,其毒性主要来自生物碱成分,黑顺片为附子的主要炮制品,临床应用广泛,其质量优劣直接关联临床安全性与有效性,严格控制其质量标准,对提高饮片质量、保证其安全有效使用具有重要意义[2]。然而黑顺片产地较多,炮制工艺步骤及其机制复杂,涉及毒效成分转化,现行《中华人民共和国药典》及各省市炮制规范未能全面反映其质量内涵。
质量标志物(Quality Marker,Q-Marker)理论由刘昌孝院士于2016年提出[3],现已得到快速发展和完善,如从药材-饮片-制剂进行系统探索[4],从“性-效-物”三元关系和作用机制进行研究[5],基于效-毒同时入手的Q-Marker研究策略等[6],黑顺片毒性虽较附子已大幅降低,但其使用限量仍不明确,有产生不良反应的风险,Q-Marker的研究,有助于建立药效-毒性-证候关联性评价,全面反映毒性中药的生物效应。指纹图谱结合化学模式识别可对数据信息进行矩阵式整合,描述药材整体化学特征的同时,反映质量差异,可在一定程度上区分药材的真伪优劣,对质量进行评价[7]。网络药理学基于系统生物学理论,从基因、蛋白等不同水平对生物学事件进行研究,其整体性与系统性特点和中医药整体观思想不谋而合,可通过构建药物靶点之间相互作用的生物网络,快速预测中药成分的潜在作用靶点和通路,并利用分子对接技术进行验证,为其机制研究奠定基础[8]。基于此,本研究收集大批量黑顺片样品,建立其化学成分的高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)指纹图谱,结合化学模式识别整体评价质量,并进一步结合网络药理学,旨在为黑顺片的质量控制和后续开发提供更为全面和可资借鉴的参考。
1 仪器与试药
1.1 仪器 Agilent Technologies 1200 Series全自动高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司,美国,货号:脱气机G1322A;二元泵G1312B;自动进样器G1367D;柱温箱G1316B;检测器G1315C);依利特SinoChrom ODS-BP色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)(大连依利特分析仪器有限公司,柱号:E2020350);FA1104N型电子分析天平(上海菁海仪器有限公司,型号:y201209056);KQ-500B型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司,货号:2018907000);DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司,货号:L-309435);旋转蒸发仪(南京科尔仪器设备有限公司,货号:1903023);循环水真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司,货号:31931961586);TGL-16GB高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂,货号:75002445);Milli-Q Integral纯水/超纯水一体化系统(Millipore,美国,货号:00071625)。
1.2 试药 苯甲酰乌头原碱(批号:20092906,纯度:98.75%)、苯甲酰新乌头原碱(批号:19062701,纯度:99.36%)、苯甲酰次乌头原碱(批号:20091402,纯度:98.23%)、乌头碱(批号:20092804,纯度:98.46%)、新乌头碱(批号:20091403,纯度:98.84%)、次乌头碱(批号:20062404,纯度:97.50%),以上对照品均购自南京金益柏生物科技有限公司;乙腈(Merck公司,德国,批号:JA108130)、四氢呋喃(TEDIA天地试剂公司,美国,批号:12100192)、甲醇(江苏汉邦科技有限公司,批号:212045),以上均为色谱纯;氨水(上海凌峰化学试剂有限公司,批号:20140126)、异丙醇(上海申博化工有限公司,批号:1606101)、乙酸乙酯(上海申博化工有限公司,批号:1711101)、乙酸铵(国药集团化学试剂有限公司,批号20181012)、乙酸(上海申博化工有限公司,批号:1501101)、盐酸(上海凌峰化学试剂有限公司,批号:20140220),以上均为分析纯,水为纯净水。
1.3 分析样品 本实验共收集25批不同产地的黑顺片,由安徽华润金蟾药业股份有限公司提供,由南京中医药大学药学院陈建伟教授鉴定为毛茛科植物乌头AconitumcarmichaeliiDebx.的子根加工品。见表1。
表1 25批黑顺片样品信息
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱:依利特SinoChrom ODS-BP色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)。流动相:流动相A为乙腈-四氢呋喃(25∶15),流动相B为0.1 mol/L醋酸铵溶液(每1 000 mL加冰醋酸0.5 mL)。梯度洗脱程序:0~15 min,15%~20%B;15~20 min,20%~21%B;20~30 min,21%~25%B;30~45 min,25%~35%B;45~50 min,35%~15%B。柱温:30 ℃。流速:1 mL/min。检测波长:240 nm。进样量:10 μL。在该色谱条件下,各组分的分离度均>1.5,以苯甲酰新乌头原碱计理论塔板数≥3 000。
2.2 对照品溶液的制备 精密称取乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰新乌头碱、苯甲酰乌头碱、苯甲酰次乌头碱对照品适量,用0.05%盐酸-甲醇溶解,配制成含乌头碱2.593 μg/mL、新乌头碱24.432 μg/mL、次乌头碱18.738 μg/mL、苯甲酰新乌头碱109.44 μg/mL、苯甲酰乌头碱15.600 μg/mL、苯甲酰次乌头碱12.552 μg/mL的混合对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备 分别取不同产地干燥黑顺片适量,粉碎,过三号筛,取样品约2 g,精密称定,至具塞锥形瓶中,加氨试液3 mL浸润,精密加入异丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液50 mL,密塞,称定重量,25 ℃以下水温超声处理30 min,放凉,再称定重量,用异丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液25 mL于圆底烧瓶中,35 ℃减压回收溶剂至干,残渣精密加入0.05%盐酸-甲醇溶液3 mL溶解,以离心力12 700×g,离心10 min,取上清液,即得。
2.4 参照峰的选择 苯甲酰新乌头原碱是黑顺片的主要成分,在所建立的色谱条件下色谱峰分离度良好,峰面积适中,色谱保留时间稳定,因此选择其为参照峰,计算各共有峰的相对峰面积和相对保留时间。
2.5 中间精密度试验 取黑顺片粉末(S1)约2 g,精密称定,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件连续进样6次,记录色谱图。以苯甲酰新乌头碱为参照峰,计算得各共有峰的相对保留时间RSD均小于0.09%,相对峰面积RSD均小于2.98%,表明仪器精密度良好。
2.6 供试品溶液稳定性试验 取黑顺片粉末(S1)约2 g,精密称定,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件测定,分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样分析,记录色谱图。以苯甲酰新乌头碱为参照峰,计算得各共有峰的相对保留时间RSD<0.08%,相对峰面积RSD<4.90%,表明该供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.7 重复性试验 取黑顺片粉末(S1)约2 g,精密称定,共6份,按“2.3”项下方法,平行制备6份供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件测定,记录色谱图。以苯甲酰新乌头碱为参照峰,计算得各共有峰的相对保留时间相对标准偏差(Relative Standard Deviation,RSD)均小于0.07%,相对峰面积RSD均小于3.40%,表明该方法重复性良好。
2.8 耐用性试验 对上述色谱条件进行耐用性考察,考察内容包括Agilent 1200、Agilent 1260、岛津LC-20ADXR 3种高效液相色谱仪和依利特SinoChrom ODS-BP、Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18、Hanbon Kromasil C183种色谱柱,在不同仪器和不同色谱柱上,均可重现出完整的图谱,表明色谱条件耐用性良好。
2.9 样品测定结果
2.9.1 指纹图谱的建立 取25批不同产地的黑顺片样品,按“2.3”项下方法分别制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件依次测定,记录色谱图。将25批黑顺片样品色谱图结果以AIA格式导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012)”软件,以S1为参照图谱,采用中位数法,进行多点校正和特征峰匹配,获得25批样品的叠加图谱并生成对照指纹图谱,共标定8个共有峰。见图1。通过对照品比对指认出6个共有峰,分别是苯甲酰新乌头原碱(峰2)、苯甲酰乌头原碱(峰3)、苯甲酰次乌头原碱(峰4)、新乌头碱(峰5)、次乌头碱(峰6)、乌头碱(峰7)。见图2。
图1 25批黑顺片指纹图谱
图2 对照图谱(A)和混合对照品谱图(B)
2.9.2 相似度评价 以生成的对照指纹图谱为标准,计算25批黑顺片样品的相似度,25批黑顺片样品的相似度范围是0.922~0.999,表明各产地黑顺片的指纹图谱相对稳定。见表2。
表2 25批黑顺片HPLC图谱的相似度
2.9.3 聚类分析 以25批黑顺片指纹图谱中8个共有峰的峰面积作为描述样品特征的变量,导入IBM SPSS Statistics软件,采用组间连接法,利用欧式平方距离作为样品的测度,进行聚类分析。欧氏距离为10时,样品可聚为2类,来自陕西汉中的S4、来自四川江油的S10和来自云南丽江的S11聚为一类,其他样品聚为一类,大部分来自四川,有少批来自云南丽江和陕西汉中。见图3。
图3 25批黑顺片聚类分析
2.9.4 主成分分析 以25批黑顺片指纹图谱中8个共有峰的峰面积为变量,运用IBM SPSS Statistics软件,以特征值和累积贡献率为依据,进行主成分因子分析,并计算综合得分。以主成分特征值>1为提取标准,得到2个主成分,主成分1特征值=4.263,方差贡献率为53.285%,主成分2特征值=2.169,方差贡献率为27.107%,累计贡献率为80.392%,表明这2个主成分可反映出黑顺片指纹图谱8个共有峰的大部分信息。由旋转后成分矩阵可知,主成分1信息主要来自共有峰1、2、3、4、8,主成分2信息主要来自共有峰5、6、7。以主成分对应的方差贡献率为权重系数计算综合得分,并进行降序排列,S4、S11、S10得分显著高于其他批次样品,与聚类分析结果一致。见表3。
表3 综合得分
2.10 基于成分-靶点-通路的网络药理学预测分析
2.10.1 成分靶点预测 指纹图谱指认出乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱6种成分,已有研究表明,以上生物碱成分为附子特有成分,存在于由附子至黑顺片的炮制全过程中,且涉及一定的相互转化,对黑顺片的安全性和有效性至关重要,具有有效、特有、传递与溯源、可测和处方配伍的“五要素”,因此,以该6种成分作为候选Q-Marker,通过PubChem Compound数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)进行搜索,将得到的化合物SMILES式输入Swiss Target Prediction数据库(https://new.swisstargetprediction.ch/)进行靶点预测,删除重复靶点,最终得到与6种化合物相关的靶点38个。
2.10.2 蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)网络构建 将筛选出的38个靶点,导入STRING 11.0数据库(https://string-db.org/cgi/input.pl)进行分析,选择物种为“Homo sapiens”,combined score选择默认阈值0.4,获得PPI网络图。共获得38个节点,60条边。将网络图信息导入Cytoscape 3.9.1软件,利用“Network Analyzer”功能对其进行可视化处理。图中颜色越深、形状越大的节点代表其度值(Degree)越大,意味着这个节点的度中心性越高,该节点在网络中就越重要,在整体中处于核心地位,CHRNA7、CHRM1、PIK3CG、SLC6A3等靶点基因可能在蛋白相互作用网络中发挥关键调控作用。见图4~5。
图4 PPI网络
图5 核心靶点排序
2.10.3 基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析 利用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)对筛选出的靶点,进行GO富集分析和KEGG富集分析。GO富集分析共得到97个生物过程(Biological Process,BP)条目,28个细胞组分(Cell Components,CC)条目,34个分子功能(Molecular Function,MF)条目,设置P<0.05,FDR<0.05,共筛出22个BP、19个CC、20个MF,富集到GO本体功能上的靶点数最小为2,选取排名前10的条目进行绘图分析。见图6。在BP层面上,这些靶点参与了信号转导(Signal Transduction)、化学突触传递(Chemical Synaptic Transmission)、药物反应(Response to Drug)等生物过程。在CC层面上,主要涉及了质膜(Plasma Membrane)、膜的整体成分(Integral Component of Membrane)、突触(Synapse)等。在MF层面上,主要存在相同蛋白结合(Identical Protein Binding)、神经递质受体活性(Neurotransmitter Receptor Activity)、激酶活性(Kinase Activity)、G蛋白偶联5-羟色胺受体活性(G-Protein Coupled Serotonin Receptor Activity)等。KEGG PATHWAY富集分析共得到99条通路,以P<0.05,FDR<0.05为筛选条件,共筛选出80条,其中富集到KEGG通路上靶点数最少为3,选取排名前20的通路进行绘图分析。见图7。图中颜色越深的点代表其富集程度越显著,胆碱能突触信号通路(Cholinergic Synapse)、阿尔茨海默病(Alzheimer′s Disease,AD)信号通路、钙离子信号通路(Calcium Signaling Pathway)、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B通路(Phosphatidylinositol-3-Kinase-Protein Kinase B Pathway,PI3K/PKB Pathway)、癌症中心碳代谢(Central Carbon Metabolism in Cancer)为较为重要的几条,此外还涉及急性髓细胞白血病(Acute Myeloid Leukemia)的发生、瞬时受体电位通道的炎症介质调节(Inflammatory Mediator Regulation of TRP Channels)。表明这38个靶点主要通过调控这些通路发挥干预疾病的作用。
图6 GO富集分析
图7 KEGG富集分析
2.10.4 成分-靶点-通路网络构建 根据筛选出的6个成分、38个靶点和排名靠前的20条通路,运用Cytoscape 3.9.1软件,构建“成分-靶点-通路”网络图。见图8。以化合物、靶点蛋白、信号通路的度值(Degree)为参考,次乌头碱有最高的连接度(Degree=37)、乌头碱次之(Degree=20)、其他4个成分连接度相近,均≥10,提示6种成分均可能是黑顺片发挥药效的活性物质;靶点PIK3CA(Degree=20)、PIK3CB(Degree=18)、PIK3CD(Degree=18)、MTOR(Degree=16)与各信号通路连接度较高,可能是作用于代谢途径、阿尔茨海默病信号通路、癌症通路、钙离子信号通路、PI3K/PKB信号通路等的关键靶点。
图8 “成分-靶点-通路”网络
2.10.5 分子对接验证 利用PDB数据库(http://www.rcsb.org/)及UniProt(https://www.uniprot.org/)数据库检索蛋白结构,设置筛选条件,选取物种为“Homo sapiens”,构象分辨率尽量≤2.5 A,序列尽量完整且复合体中有小分子配体信息。筛选出蛋白结构对应的PDB ID分别为PIK3CA(6I1S)、PIK3CD(6PYR)、MTOR(4DRI),PIK3B于UniProt数据库中获得。运用Auto Dock软件,将筛选出的6个成分与4个度值最高的靶点依次进行分子对接,同时以相应靶蛋白的阳性药进行对照验证,并将结果导入PyMOL绘图软件绘制结合模式。对接打分值代表受体与配体之间亲和力,其值越小,则结合越容易。结果显示,6个成分与4个核心靶点的结合能均<-7 kJ/mol(1 cal=4.184 J),且与PIK3CB、PIK3CD的结合能均小于阳性药,与另外2个靶点的结合能与阳性药相近,说明6种成分与4个核心靶点间均具有较好的结合活性,可自发结合。见图9。
图9 部分分子对接示意图
3 讨论
本实验以《中华人民共和国药典》(2020年版)附子项下色谱条件为基础,结合大量文献[9-14]对其流动相、洗脱梯度、提取溶剂、扫描波长、柱温等进行优化。发现最佳pH值约为5.8,可有效分离各生物碱成分;240 nm检测波长下基线更为平滑稳定;异丙醇-乙酸乙酯(1∶1)为提取溶剂,0.05%盐酸-甲醇溶液为复溶剂时,谱图背景更干净,且分离度良好,峰形对称尖锐。
指纹图谱的相似度结果显示,大部分黑顺片的指纹图谱具有良好的一致性,说明样品质量较为稳定。聚类分析和主成分分析结果显示,样品S4、S10、S11可聚为一类,主成分分析中综合得分和散点图也将这3批样品与其他样品较好地分开,结果一致。四川是附子的道地产区,云南、陕西也为附子主产地,这3批样品分别来自3个产地,共有峰峰面积之和均显著高于同产地的样品,主要由苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱造成,推测由地域差异、炮制加工过程的不同等导致。附子炮制过程步骤繁多,尤其在蒸、煮环节,是影响生物碱转化与含量的关键步骤,2020年版《中华人民共和国药典》记载了黑顺片的炮制流程,但并未明确规定各环节参数,可能是造成产地相同的黑顺片也存在较大差异的主要原因[15]。
目前尚无附子或黑顺片质量标志物的相关文献报道,仅有对真武汤、参附方等含附子的复方的质量标志物研究,其中,苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、次乌头碱、乌头碱、新乌头碱均可作为质量标志物[16-17]。本实验基于指纹图谱指认成分,进行网络药理学分析,建立“成分-靶点-通路”网络图,根据度值大小,预测次乌头碱等6种成分可能是黑顺片发挥作用的主要活性物质,通过代谢途径、钙离子信号通路、PI3K-Art信号通路、肿瘤通路等多条通路,作用于PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、mTOR等关键靶点干预疾病,分子对接验证了这一结果。现代药理研究表明,黑顺片具有抗炎、镇痛、抗肿瘤、保护心血管、免疫调节的作用[18],而PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、MTOR等关键靶点,癌症通路、钙离子信号通路、PI3K/PKB信号通路等关键通路,恰好在肿瘤发生与发展、抗炎、心脏功能调节、细胞糖代谢中起着重要作用[19-21],佐证了6种成分作为质量标志物的合理性。例如次乌头碱可通过抑制转化生长因子-β1,抑制肺癌细胞A549的黏附、迁移和侵袭能力[22];通过抑制细胞高迁移率族蛋白B1的分泌和释放,对抗细胞内皮损伤[23]。乌头碱可通过抑制JAK2/STAT3信号通路而抑制前列腺癌细胞增殖、侵袭,诱导细胞凋亡[24];通过ROS/JNK信号通路诱导人骨肉瘤143B细胞发生凋亡[25];抑制核因子κB激酶亚基B、IκBα的磷酸化,从而抑制核因子κB信号通路活化,治疗类风湿性关节炎[26];还可通过激活SIRT3分子使其发挥去乙酰化作用,改善线粒体功能,调节能量代谢,保护心肌组织[27]。
然而,度值较高的2种生物碱均为毒性较大的双酯型生物碱,在发挥疗效时,也可能造成严重的中毒反应,如适宜浓度的次乌头碱对H2O2所致的心肌细胞凋亡有明显的改善作用[28],用量过多则可能引起心肌细胞内游离Ca2+升高和Cx43表达下降,诱发心律失常,或引起心肌细胞死亡[29-30]。不同的生物碱针对同一疾病也可能发挥截然相反的作用,如乌头碱可抑制黑色素瘤B16细胞的生长从而发挥抗癌作用[31],次乌头碱则会通过瞬时电位受体香草素4介导的钙离子内流激活ROCK/MLC2信号轴,使黑色素瘤向远端转移[32]。
综上所述,6种生物碱的含量范围是黑顺片质量优劣的关键所在,如何避免减毒过度致药效不佳,或炮制不及造成不良反应,可通过炮制工艺与生物评价相结合,研究关键步骤的量-毒-效关系与成分转化机制,与实际病症相结合,进一步阐明黑顺片安全性与有效性的科学内涵。
利益冲突声明:无。