糖耐康改善KKAy小鼠Toll样受体4通路及葡萄糖转运子4的作用机制研究

王 芬 何华亮 刘铜华 吴丽丽

(1 北京中医药大学第三附属医院,北京,100029; 2 中国人民解放军武装警察部队北京总队医院,北京,100027; 3 北京中医药大学教育部中医养生学重点实验室,北京,100029)

目前,2型糖尿病已成为世界范围所面临的严重的公共卫生问题。据统计全球糖尿病的医疗成本已达人均医疗保健支出的3.2倍,而糖尿病并发症的医疗成本已增加9.4倍[1]。国际糖尿病联盟预计,2015年全球糖尿病患病率达4.15亿,到2040年将增至6.42亿人[2]。众所周知,肥胖及超重与2型糖尿病发病密切相关,因其数量的快速增长,已成为代谢性疾病风险更高的预测因子[3-4]。现已公认,机体的慢性炎症反应参与了有关肥胖及胰岛素抵抗的一系列病理过程,也是2型糖尿病的发病机制之一[5]。故有人呼吁将抗炎剂纳入2型糖尿病的治疗方案中[6]。为此,加强炎症通路靶点的研究具有重大的现实意义。

中药复方糖耐康是治疗2型糖尿病的经验方,是以辨证论治为基础并结合多年临床经验及药理研究成果组方而成。前期研究结果显示,该方具有能够改善胰岛素抵抗、调节糖脂代谢、调节肠道菌群等的作用[7]。为进一步探究其作用机制,本研究选取与肠道菌群密切相关的脂多糖介导的Toll样受体通路中部分炎症介质作为观察指标,现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 10周龄无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级雄性KKAy小鼠65只,雄性C57BL/6J小鼠13只[北京华阜康生物科技有限股份公司,许可证号:SCXK(京)2014-0004],体质量(35.5±3.0)g。在SPF级条件下,饲养于中国中医科学院中医基础理论研究所实验动物中心。饲养条件:温度(21±2)℃,湿度(60±10)%,12 h/12 h光照黑暗循环。合格证号:SYXK(京)2016-0021。符合实验动物伦理委员会相关指导原则,由动物实验伦理会审查批准(伦理审批号:2019-067)。普通饲料及高脂饲料(猪油10%、蛋黄粉10%、普通饲料80%)均由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。

1.1.2 药物 中药糖耐康颗粒由北京海德润制药有限公司制备。由人参、女贞子、夏枯草、三白草、番石榴叶,按1∶4∶2∶4∶2比例组成。3 g/袋,1 g颗粒相当于生药3.61 g。实验前用蒸馏水配制,超声30 min后4 ℃保存。阿卡波糖片(德国拜耳医药保健有限公司,批号:BJ51061)。

1.1.3 试剂与仪器 IL-6酶联免疫试剂盒(武汉优尔生科技股份有限公司,批号:L150715400)。Formamide去离子甲酰胺(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司,批号:37B00160)、核酸染料(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司,批号:54D00150)、2×Taq PCR GreenMix(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司,批号:55H001200)。蛋白质分子量Marker(Bio-rad,美国,批号:310007919),聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜(Millipore,德国,批号:K1EA1531FK)、磷酸化蛋白酶抑制剂(Roche公司,瑞典,批号:19987800),TLR4兔来源的多克隆抗体(Abcam公司,美国,批号:GR3218684-1),IKK兔来源的单克隆抗体(Abcam公司,美国,批号:GR3218250-2),GAPDH小鼠来源的单克隆抗体(Abcam公司,美国,批号:GR232949-14)。

紫外分光光度计(Eppendorf公司,德国,型号:Biophotometer),微量加样器(Eppendorf公司,德国,型号:Eppendorf Research plus),生物分析仪(Agilent Technologies,Palo Alto,美国,型号:Agilent 2100),荧光定量仪(Invitrogen,Carlsbad,加拿大,型号:Qubit 2.0 Fluorometer),高通量测序仪(Illumina公司,美国,型号:HiSeq 2500型),高通量测序仪(Illumina公司,美国,型号:Illumina MiSeq),超净工作台(东联哈尔仪器制造有限公司,型号:DL-CJ-2NDI型),电子天平(Sartouris公司,德国,型号:BS224S型),垂直电泳槽(Bio-Rad公司,美国,型号:MP3型)、高速低温离心机(Bio-Rad公司,美国,型号:3K15型),半干转电转印仪(Bio-Rad公司,美国,型号:TransBlot SD型),稳压稳流电泳仪(Bio-Rad公司,美国,型号:Powerpac HQ型),梯度PCR仪(Bio-Rad公司,美国,型号:T100型)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 小鼠适应性喂养2周,以雄性C57B/6J小鼠设为正常组,喂养普通饲料;高脂饲料喂养雄性KKAy小鼠2周,以随机平均血糖≥13.9 mmol/L,设为成模小鼠,共65只。设C57B/6J小鼠13只为正常组,KKAy小鼠按体质量及血糖随机分为5组,包括阿卡波糖组、糖耐康高剂量组、糖耐康中剂量组、糖耐康低剂量组、模型组,每组13只。

1.2.2 给药方法 给药剂量:阿卡波糖组按3.9 mg/kg,糖耐康高剂量组、糖耐康中剂量组、糖耐康低剂量组分别按4.68、2.34、1.17 g/kg,模型组按生理盐水20 mL/kg。给药组均按0.01 mL/g的体质量标准灌胃给药1次,正常组和模型组给予等同剂量的生理盐水灌胃1次,连续8周。过程中,中剂量组及模型组各死亡3只。喂养过程中,每周监测小鼠血糖和体质量,小鼠均自由取食、饮水。8周后,末次给药后禁食不禁水12 h,于眶静脉取血,分离血清备用。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 血糖及体质量检测 给药期间,于第0、4、8周,禁食6 h后,血糖检测以血糖仪尾静脉取血进行;每周同一时间测量体质量并记录。

1.2.3.2 半定量酶联免疫吸附试验法及蛋白质免疫印迹法检测 半定量酶联免疫吸附试验法检测血浆中白细胞介素6(Interleukin,IL-6)及葡萄糖转运蛋白4(Glucose Transporter4,GluT4)的水平。各项操作均严格按照说明书操作。

2018年6月11日稗草1-3叶期，将4%氟嘧啶草醚+2.5%五氟磺草胺可分散油悬浮剂100毫升/亩。甩施，施药后保持水层3-5厘米7天以上，田间管理同一般生产田。

蛋白质免疫印迹法检测肝组织、肌肉组织中Toll样受体4(Toll-likeReceptor4,TLR4)及核因子κB激酶β抑制物(Inhibitor of NF-kappaB Kinase Beta,IKKβ)水平。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳:上样量约40 μg,90 V 45 min浓缩,150 V 80 min电泳分离。转膜:按照海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵依次顺序装好转膜装置120 V、150 mA转膜60 min。封闭:15 mL Blocking buffer TTBS 37 ℃轻摇1 h。加TLR4一抗(1∶1 000)、IKKβ一抗(1∶1 000),GAPDH为内参(1∶5 000)。4 ℃孵育过夜,洗膜,加二抗,TLR4二抗(1∶2 000)、IKKβ二抗(1∶2 000),GAPDH为内参(1∶3 000)。增强化学发光,Storm扫描,对扫描图像测特异蛋白条带的灰度值。以β-actin为内参照,每个样品重复测量3次。

2 结果

2.1 糖耐康对KKAy小鼠空腹血糖和体质量的影响 与治疗前比较,各给药组血糖有明显下降;与模型组比较,糖耐康高剂量组、阿卡波糖组差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);除正常组外,各组体质量均有不同程度上升,与模型组比较,各给药组差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 各组KKAy小鼠空腹血糖和体质量比较

2.2 糖耐康对KKAy小鼠IL-6、TLR4、IKKβ水平的影响 与模型组IL-6比较,阿卡波糖组和糖耐康高剂量组差异有统计学意义(P<0.01)。与正常组比较,模型组GluT4水平明显下降(P<0.05);与模型组比较,糖耐康高剂量组与阿卡波糖组均能够明显上调GluT4水平(P<0.01)。见表2。

表2 各组KKAy小鼠IL-6、GluT4水平比较

2.3 糖耐康对KKAy小鼠TLR4、IKKβ水平的影响 与正常组比较,模型组TLR4、IKKβ水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,糖耐康高剂量组与阿卡波糖组能够显著下调TLR4、IKKβ水平(P<0.01)。见表3,图1～2。

图1 糖耐康对肝组织TLR4蛋白表达的影响

图2 糖耐康对肌肉组织IKKβ蛋白表达的影响

表3 各组KKAy小鼠TLR4、IKKβ水平比较

3 讨论

因肥胖导致肠道微生物群失调,致细菌及其产物如脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)泄漏到脂肪组织,能够激活脂肪细胞中的TLR,其中,TLR4作为细胞膜表面受体,能够诱发机体产生各种细胞因子,尤其是炎症介质和相关酶类等[8-10]。已知经典的TLR4通路主要参与LPS的识别和转导[11-12],LPS在机体内通过活化TLR4,降解IKB,来解除对核因子κB的抑制,而后进入核内促进炎症介质包括TNF-α、IL-6等的转录,进一步促进核因子κB的活化,形成局部炎症扩大的级联效应[13]。各种细胞因子和促炎趋化因子,一旦被激活,就会加剧炎症介质的产生,从而激活应激激酶,有效地阻止胰岛素受体的信号转导通路并引起胰岛素抵抗[14-15]。因此,调节炎症介质,可恢复胰岛素的敏感性和改善异常血糖[16]。鉴于各种脂肪因子、细胞因子和趋化因子对疾病进展的影响,可将2型糖尿病视为一种自身炎症性疾病,尽管它是由代谢失调引起的[17]。另外,GluT4是葡萄糖转运体家族的成员之一,能够转移并定位在细胞膜上,促进葡萄糖的吸收,故在骨骼肌的葡萄糖转运和代谢过程中发挥了重要作用[18]。胰岛素抵抗时,因GluT4的转位受阻,可影响糖脂代谢[19-20]。具体表现可见GluT4的易位受阻、表达减少,及含GluT4的囊泡不能与细胞膜融合,或者已融合但其活性降低等[21],这些都是胰岛素抵抗的中心环节[22]。因此,上调GluT4的活性及转位也是增强胰岛素敏感性和改善骨骼肌代谢的有效途径之一。

综上所述,中药糖耐康能够明确改善2型糖尿病小鼠的血糖水平。在体质量方面,KKAy小鼠组体质量均有不同程度上升,考虑与其高脂饲料喂养有关。而与模型组比较,各给药组具有明显抑制体质量增长的趋势。对于IL-6水平,与模型组比较,阿卡波糖组与糖耐康高剂量组均具有明确的下调作用,其余给药组有一定的下调趋势。对于GluT4水平,与模型组比较,阿卡波糖组与糖耐康高剂量组具有明确的上调作用。对于TLR4及IKKβ水平,与模型组比较,各给药组均有下调趋势,其中糖耐康高剂量组及阿卡波糖组最为显著。

糖耐康是由夏枯草、番石榴叶、三白草、女贞子及人参5味药组成。方中君药夏枯草,清肝火散郁结。主要针对消渴病热盛内郁的病机。番石榴叶、三白草为臣药,番石榴叶能够甘平养胃,生津止渴,敛涩固阴。早在1975年广西医学院糖尿病课题组就发现其有确切降糖作用,药理研究已证实它能够改善糖尿病胰岛素抵抗。三白草清热解毒、利水消肿。方中君、臣药主要针对消渴病燥热内盛的病理基础。佐药人参、女贞子益气养阴、生津止渴,针对气阴亏虚的病理基础。全方共凑清热生津、益气养阴之效。是在辨证论治与专药专方相结合的基础上,正对糖尿病及前期——胰岛素抵抗的主要病机特征。

KKAy小鼠是自发性2型糖尿病动物模型,因其具有与人类糖尿病类似的遗传特征及发病过程,个体差异性较小[23],成模稳定,已在实践过程中得到较好的论证,是研究该疾病理想的动物模型。

本研究结果证实,中药糖耐康不仅能够降低2型糖尿病小鼠的体质量趋势及血糖水平,而且能够下调炎症介质IL-6及上调胰岛素受体后通路中GluT4的水平,下调肝脏、肌肉组织中TLR4及IKKβ蛋白表达。说明其可能通过调节LPS介导的TLR4通路中关键炎症介质的水平,减轻炎症反应,在一定程度上抑制炎症级联效应,从而减轻胰岛素抵抗状态。当然,肠道菌群结构的改变也参与其中。该结论为进一步加强中医药防治糖尿作用机制的研究提供理论依据。

利益冲突声明:无。