地中海贫血预防和诊疗技术进展

张婷婷, 徐湘民

南方医科大学南方医院地中海贫血诊治创新研究中心、南方医科大学基础医学院医学遗传学教研室(广东广州 510515)

全球有5%～20%的人群携带α-地贫基因和1.5%的人群携带β-地贫基因,超过90%的患者分布在热带和亚热带地区[1]。中国南方大部分省(自治区)是地贫高发区,我们的研究显示中国南方人群α-地贫的平均携带率为16.77%,β-地贫的平均携带率为4.70%[2],该病高发地区的遗传负荷已成为严重的公共卫生问题[1-2]。地贫发病机制及表型异质性等方面的基础研究进展为该病预防、诊治及其技术研发和应用奠定了基础,地贫筛查技术、诊断方法和治疗方案的进步为降低地贫患儿出生率和改善患者的生活状态提供了技术支撑[3-4]。同时,技术的进步促进基础研究的发展,二者相辅相成。基因治疗新技术的发展和BCL11A等β-地贫表型重要修饰基因的发现为地贫患者提供了新的治疗方案[5-6],同时也带动了β-地贫基因治疗领域的临床研究和治疗实践;近十多年来高通量测序技术的快速发展推动了该领域的基础研究和临床应用。包括地贫在内的血红蛋白病更多的遗传突变位点被发现,为临床精准诊断和遗传咨询提供了保障[7];目前世界上3个血红蛋白病专病数据库:HbVar(http://globin.bx.psu.edu/hbvar)、IthaGenes(https://www.ithanet.eu/db/ithagenes)和本团队建立的Leiden开放变异-中国数据库(Leiden Open Variation Database-China,LOVD-China,http://www.genomed.zju.edu.cn/LOVD3/genes)[8-10]。其中本团队建立的数据库,全面系统记录了中国人群α-和β-珠蛋白基因簇上的变异及每个变异的详细信息,并首次创建了血红蛋白病在线辅助精准诊断和风险评估系统[10]。

1 表型筛查技术及其应用

通过在地贫高发区进行公共卫生教育、实施大规模的地贫人群筛查和产前诊断计划,已有效减少了该病患儿的新生儿出生数量,针对地贫的成功实践成为历史上单基因病人群防控的典范[11]。大规模人群表型筛查是产前诊断的基本前提,传统上,应用血细胞自动分析仪,首先通过全血细胞计数(full blood counting,FBC)技术,采用平均红细胞体积(mean corpuscular volume,MCV)、平均红细胞血红蛋白含量(mean corpuscular hemoglobin,MCH),以及血红蛋白A2(Hb A2)含量作为检测指标,对婚前和孕早期育龄夫妇进行常规筛查,当受检个体表现为小细胞低色素贫血特征时,即视为阳性地贫携带者,并通过Hb A2含量的改变初步区分为α-和β-地贫携带者[11-12]。表型筛查中,常应用凝胶电泳、毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)或高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)等血红蛋白检测技术,筛查异常血红蛋白及各种血红蛋白含量,用于辅助地贫类型的初步诊断[4,11]。表型筛查的目的是发现高风险夫妇,当夫妻双方经基因诊断进一步确诊为同种地贫(夫妻同为α-或β-地贫)基因突变携带者时,即被确定为产前诊断的适应对象[11]。产前诊断应用的主要技术手段以DNA诊断为基础,主要通过3种有创性取材方法:绒毛取样、羊膜腔穿刺和脐带穿刺,获得足量的胎儿DNA样本后,结合家系分析进行基于胎儿地贫基因突变检测的产前诊断,诊断为地贫患者的胎儿,可通过选择性流产终止妊娠达到地贫预防的目的[11-12]。

上述传统筛查所针对的血细胞和血红蛋白检测对象,在技术特异性上有明显缺陷,且操作流程繁琐,近几十年来血红蛋白病的高通量质谱筛查新技术不断发展[13],其中针对疾病发生特异性改变的珠蛋白肽链的质谱检测技术引人注目,如串联质谱(tandem mass spectrometry,MS-MS)和基质辅助激光解吸飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)技术[14-15]。前者是在胰蛋白酶消化后基于α-珠蛋白链的蛋白特异性肽段靶分子分析策略,以稳定的同位素标记的肽作为内标进行定量进而得到每个样品中血红蛋白的浓度。该方法能同时实现血红蛋白变体的定性分析和血红蛋白的定量检测,可用于α-和β-地贫的筛查;后者是一种不需要酶解肽段步骤,即基于完整珠蛋白肽链进行快速检测的分析策略,直接准确定性和定量不同珠蛋白链的丰度比。本团队已建立了用于β-地贫及异常血红蛋白筛查的MALDI-TOF MS技术方案,并通过大规模人群样本和临床病例分组样本的应用评价,证明该方法具有快速、简便、准确和低成本的性能优势,适用于大规模人群筛查,并可很好区分临床上的中间型和重型β-地贫[15]。针对α-地贫新标志物[16]的同类MS筛查技术正在研发中,基于珠蛋白全肽链的质谱检测新技术,有望成为未来检测血红蛋白病的“一线筛查方法”(‘First Line Screening Assay’),从而改变传统的地贫遗传筛查操作流程。

2 分子诊断技术及其应用

根据血液学表型筛查结果检出阳性样品后,需利用DNA检测技术在分子水平上鉴定致病基因[β-珠蛋白基因(HBB)或α-珠蛋白基因(HBA)]的突变类型及基因型,这样才能达到确诊的目的。地贫的传统分子诊断一般以PCR技术为基础,国内外比较成熟的诊断缺失型α-地贫和δβ-地贫/HPFH大片段缺失,多采用跨越断裂位点(Gap-PCR)和多重连接依赖探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)技术[4,11-12],前者应用于检测常见的缺失型α-地贫突变—-α3.7,-α4.2和--SEA等,后者用于检测目标序列的拷贝数异常以及大片段缺失,除验证已知缺失类型的突变外,通常也用于鉴定未知大片段缺失型的地贫样本。检测地贫基因点突变的技术有PCR结合反向斑点杂交(reverse dot blot,RDB)和分子信标探针熔解曲线技术[17-18]等,这些技术均依据已知突变位点及序列设计探针,用于检测α-或(和)β-地贫突变及其基因型。传统分子诊断技术均具有局限性,如Gap-PCR和PCR-RDB实验操作过程较繁琐,检测突变种类数少;MLPA分析则受限于其探针所覆盖范围,且操作过程复杂、耗时长,不适用于大样本检测;熔解曲线技术突变图谱复杂,结果判定需要足够的经验,且受技术稳定性影响等。

近10多年来,随着高通量测序技术的发展,使地贫的诊断更加全面与快捷。应用于全基因组、外显子组或靶向基因组的二代测序技术(next-generation sequencing,NGS)可快速高通量地全面检测各种遗传变异,不仅能检测出整个珠蛋白基因编码区及其关键调控区的遗传变异,同时也能检出该病的遗传修饰基因突变,除有助于实现个体化精准诊断外,也为开展地贫的遗传病理机制研究提供了有用的工具[2]。基于长读长的第三代测序技术(third-generation sequencing,TGS)在检测大片段缺失以及拷贝数变异(copy number variation,CNV),尤其针对同源性高、GC含量丰富的DNA序列检测上具有技术优越性,能够准确区分HBA1和HBA2基因以及β-珠蛋白基因簇上有诊断价值的高度同源序列,正确辨别复杂结构变异和同源重组的真实遗传携带者状态,已成为一种准确高效的地贫检测新方法,并在地贫的产前诊断应用中被证明,TGS较基于PCR方法可以提供更多的遗传检测信息[7,19]。与传统的基因分型方法相比,NGS和TGS方法可以满足基因组水平广泛遗传变异的一次性分析,如α-和β-地贫的共遗传,红系先天性贫血多病共存,致病基因和遗传修饰突变对表型的贡献,罕见突变的发现等,以及绘制准确的α-和β-基因簇单倍型等。高通量测序技术代表了遗传检测的发展趋势,该技术在血红蛋白病领域的应用我国处于领先水平,我们组织国内团队与华大基因合作,推动了NGS技术应用于地贫遗传检测的发展[2],2022年华大基因研制的基于NGS的α-和β-地贫基因检测试剂盒,已取得国家药监局的医疗器械注册证。目前,包括我们团队在内,国内外正致力于研发基于高通量测序的用于地贫无创产前诊断[20-21]和植入前诊断[22]的适宜技术。用于地贫“分子筛查”(‘Molecular Screening’)的高通量技术是未来可预期的发展方向。

3 遗传治疗技术及其应用

长期规范性输血结合铁螯合剂祛铁治疗是临床上治疗重型β-地贫(输血依赖性β-地贫,transfusion-dependent thalassemia,TDT)患者的常规手段,也是保障患者生命的维持疗法。而造血干细胞骨髓移植(bone marrow transplantation,BMT)是能根治TDT患者的临床治疗手段。该疗法将与患者人类白细胞抗原(HLA)匹配的供者的造血干细胞植入患者体内,即通过异基因造血干细胞移植达到根治目的。国内外TDT造血干细胞治疗都是从全相合骨髓移植开始,再发展为半相合骨髓移植,我国虽然这一领域的工作起步较晚,但经过20多年的临床实践,我国的TDT半相合干细胞移植进展迅速,治疗成功率显著提升,目前已达到国际领先水平。尽管如此,受移植配型供者来源匮乏,患者年龄及健康状况指标等因素制约,骨髓移植的受益者人数仍十分有限[1]。

随着病毒载体和基因编辑技术的不断成熟,近几年来,针对TDT患者的基因治疗临床研究和应用取得了重大突破,正在成为目前临床上根治β-地贫的可选择的新疗法[1,5]。自体干细胞离体回输(ex vivo)是目前TDT基因疗法的主要策略,即从患者体内获取CD34+造血干细胞,离体细胞在体外进行基因修饰,修饰的治疗细胞再回输到患者体内。采用患者自体干细胞避免了移植免疫排斥风险,这也是基因治疗的技术优势,同时,基因治疗技术会给成人TDT患者带来希望。BMT是基因治疗的基础,移植前清髓预处理方案是保证基因治疗成功的重要环节[23]。目前国内外TDT基因治疗有两种技术方案:(1)携带β-珠蛋白基因(HBB)的慢病毒载体技术,即在患者CD34+细胞中转染经修饰的HBB,替代体内突变基因,恢复β-珠蛋白链的正常表达;(2)采用基因编辑技术修饰患者CD34+细胞中抑制γ-珠蛋白基因(HBG)的转录因子BCL11A,或直接修饰HBG调控原件,使胎儿血红蛋白(Hb F)重新激活,替代体内缺失的成人血红蛋白(HbA)。目前由蓝鸟公司(Bluebird Bio)生产,采用一次性给药治疗TDT患者的慢病毒载体制剂(Betibeglogene autotemcel,beti-cel)[24],已经获得欧洲和美国药监部门的批准,成为世界上首款上市的TDT基因疗法新药。此外,至少还有4款用于β-血红蛋白病(TDT或镰状细胞贫血)治疗的慢病毒载体或基因编辑制剂已经取得了欧美的新药临床试验申请(investigational new drug,IND)批准[25-28]。国内的生物技术公司与高校和医院合作,正在积极推进具有自主知识产权TDT基因治疗技术的临床研究,目前已有3款用于治疗TDT的基因编辑技术的IND申请获国家药监局批准,正在开展新药临床试验[29-30];还有2款TDT慢病毒载体新药正在开展研究者发起的临床试验,目前国内已实施了30多例TDT基因治疗。上述国内外新药已经完成或正在开展的临床试验,多数取得了使TDT患者摆脱输血依赖的令人欣喜的临床疗效。近期,国内研究团队采用慢病毒载体技术完成了世界首例输血依赖型α-地贫患儿的基因治疗,也取得“摆脱输血”的临床疗效。

4 结语

综上所述,近10多年来该领域在发展地贫预防和诊疗新技术上有了长足的进步,基于珠蛋白肽链特异性分析的高通量质谱新技术为全面快速筛查地贫提供了新的解决方案。高通量测序技术可高效检出更广泛和复杂的地贫遗传变异,弥补了传统分子诊断的局限性,代表了未来地贫遗传检测的发展方向。我国β-地贫半相合骨髓移植先进方案的应用,以及国内外β-地贫自体干细胞基因治疗临床试验所取得的显著疗效,为改善地贫患者生活质量、减少疾病负担带来了新希望。

利益相关声明:所有作者声明无利益冲突。

作者贡献说明:张婷婷负责论文撰写及修改,徐湘民负责论文指导及修改。