动物细胞悬浮培养技术在兽用疫苗生产中的应用

2023-12-20刘玉静刘召明杨香芳赵同渊王翠菊王琳

中国动物保健 2023年11期

刘玉静，刘召明，杨香芳，赵同渊，王翠菊，王琳

（青岛易邦生物工程有限公司山东青岛 266113）

在20 世纪60-70 年代，科学家们建立了微载体悬浮培养体系，同时创建了空纤维细胞培养技术，为在体外进行大规模的细胞培养创造了可能[1]。细胞悬浮培养技术是指通过使用生物反应器，在人工条件下，对用于生物制品当中的动物细胞进行大规模高效率的培养技术。随着生物技术的不断革新、发展，动物细胞悬浮培养技术已经广泛地用于病毒的大规模培养当中，这项培养技术具有非常高效的生产效率，同时还具有高质量与生物安全容易掌控等多方面的优点。在细胞悬浮培养中用于体外培养的细胞绝大多数为动物源性，因此这项技术在兽用疫苗的制备当中得到了很好的运用。细胞悬浮技术根据动物细胞贴壁能力的差异，又被分为了全悬浮和贴壁悬浮这两种培养方式。

1 细胞悬浮培养的关键技术

1.1 选择和悬浮驯化动物细胞系

在动物疫苗的生产过程当中，安全性、有效性和成本控制是疫苗生产最主要的几点考虑因素，只有如此才能提高兽用疫苗生产的生产效率，同时确保生物产品的质量具有可靠性。在生产过程中，做好动物细胞系的选择和驯化这两个方面，对以上几点要求的优化达标具有非常重要的意义。由于同一种细胞和准备扩增的病毒之间能够产生相互作用，因此在应用某细胞系进行大规模的疫苗生产之前，应该提前与目标病毒进行相互的适应性选择。同时，所选细胞的生长特性对能否进行大规模增殖培养，以及使用哪种工艺进行增殖培养具有决定性的作用，这是由于同一种细胞在不同的培养状态下对病毒的敏感程度也不尽相同[2]。另一方面，这项技术对悬浮细胞的繁殖效率、活力以及生物稳定性等均具有较高的要求，驯化是细胞悬浮的首要任务，特别是对于贴壁细胞来说，在微载体悬浮培养的状态下会明显的改变贴壁细胞的生长状态，因此稳定性是细胞驯化过程中最重要的考虑因素，在实际的生产过程中，可以通过逐渐降低培养基中血清的浓度来达到维持较高稳定性的目的。若在培养过程中细胞受到了损伤，就难以恢复原状，因此在整个驯化的过程中，最好能够令细胞的活力维持在90%以上。

1.2 最适培养基的选择

选择适宜的培养基是细胞悬浮培养技术中最为关键性的环节。一般情况下，动物细胞的生长必须存在血清这种营养成分，但由于血清的组成成分比较复杂，并且存在价格高昂，不同批次间血清组成成分差异较大等弊端，导致这种培养基在实际的疫苗生产当中难于应用。当前，随着技术的不断革新，这种血清培养基已经被逐渐替代为无血清培养基，有效降低了血清培养基容易被污染的情况，同时还在一定程度上降低了生产的成本。但由于细胞培养对培养基具有较高的选择性，单一一种无血清培养基无法适用于多种细胞系的培养，这就促使了个性化无血培养基的快速发展，可以在无血清培养基当中加入适量的转铁蛋白、胰岛素或者纤连蛋白等特定的生物活性物质，以促进动物细胞的快速繁殖生长[2]。据当前的研究报道，在大部分疫苗生产和组织工程细胞扩大培养过程中已经融入了无血清微载体培养技术[3]。但在实际操作中发现由无血清培养所引发的细胞凋亡问题，仍然阻碍着细胞悬浮技术的应用发展。

1.3 选择恰当的生物反应器

作为细胞悬浮培养技术中心的关键性设备，生物反应器主要是利用细胞或者酶作为生物催化剂，同时还能够为细胞的生长繁殖提供一种无菌环境。其最大的优势就是能够进行逐级放大，而由于疫苗生产的成本会受生产细胞规模的影响，因此生物反应器的选择就直接影响到了疫苗生产成本。在疫苗生产中对生物反应器的要求通常包括以下几点：生产效率高、可靠性较强、生产成本较低、安全性能强、活性较强、便于控制质量和回收，同时具有较高的细胞密度。在实际生产中应用较多的有以下几种生物反应器，分别是：流床式生物反应器、气升式生物反应器和旋转式细胞培养系统等[2]。

1.4 生产工艺的选择

生产工艺的选择决定了细胞悬浮培养技术最后的投入加工过程，按照培养方式的不同可以分为以下5 种：分批式、流加式、半连续式、连续式以及灌流式操作等几种操作模式。不同的生产工艺具有其自身的特点与优势，同时还具有自身相对应的生物反应器的类型，在实际生产过程中，可以根据所培养细胞的不同和所生产的疫苗种类，进行灵活的优化选择。

2 动物细胞悬浮培养技术在兽用疫苗生产中的应用

2.1 在猪病疫苗生产中的应用

随着我国生猪养殖业规模化与集约化程度的不断加深，各种传染性疫病的发生率也在逐年提高，如常见的猪蓝耳病、伪狂犬病、猪瘟、猪细小病毒以及猪圆环病毒病等均会对生猪养殖业造成巨大的危害。而控制这些疾病最好的办法就是按照规定接种相关的疫苗，正是得益于动物细胞悬浮培养技术的成熟与发展，让各种兽用疫苗的大批量生产成为现实，同时还保证了生物安全性。例如冯磊等[4]就利用了微载体悬浮培养技术将猪蓝耳病病毒在Marc-45细胞上进行了大规模的培养，并且成功地取得了较高的病毒效价。王建超等[5]则利用Vero 细胞悬浮培养系统大规模地生产出了猪流行性腹泻病毒，并且发现随微载体浓度的提高，所获得的最高细胞密度也在提高，同时利用CelliGen 生物反应器，将培养条件进一步优化，制备出了具有较好免疫原性的疫苗。

2.2 在鸡病疫苗生产中的应用

鸡是我国重要的畜禽产品，特别是鸡蛋、肉类在国民生活中占据着重要的地位，但鸡病的控制也给养殖业带来了巨大的困扰。尤其是一些病毒性的传染性疾病，可以给养殖者带来巨大的危害，通过科学合理的接种疫苗，能够最大限度地降低传染性疫病给鸡养殖业所带来的损失。在我国利用SPF 鸡胚进行扩增是生产禽用疫苗最为常见的方法，但这种方法对于鸡胚的培养周期、操作、来源以及是否受到了污染等因素具有较高的要求，同时难于在短时间集齐大规模生产所用的数百万枚的SPF 鸡蛋。基于细胞悬浮培养技术，在国内外已经实现了利用细胞悬浮培养大批量的生产禽用疫苗。在我国有公司利用Vero 细胞悬浮培养技术成功生产出禽流感疫苗，也利用该项技术生产出了符合国内兽用生物制品标准的鸡传支H120 细胞弱毒疫苗[2]。石岗等[6]通过Vero 细胞悬浮培养技术实现了鸡传染性法氏囊病疫苗的规模化生产。

2.3 在其他畜禽疫苗生产中的应用

除上述对单一的物种传染性较强的致病源以外，还有一些人畜共患的致病源，流行的范围较为广泛，危害性也比较强，可以通过接种疫苗的方式进行预防控制。例如李薇等[7]通过Vero 细胞悬浮培养技术对乙型脑炎病毒疫苗的大规模生产进行了探究，并且为进一步放大创造了新思路。国内外研究人员利用细胞悬浮培养技术均对甲型H1N1 流感疫苗的制备进行了探究，并且发现在MDCK细胞中使用微载体培养能够达到较高的细胞密度。