嫁接缓解烟草低钾胁迫的生理机制研究

胡玮，邸青

（重庆市农业科学院，重庆 401329）

作为一种大量营养元素，钾不仅能够影响烤烟（Nicotiana tabacum Linn.）的生长状况，同时也是烟叶质量的评价标准之一，是我国优质烤烟生产的一个重要限制因素。核酸、蛋白质、碳水化合物的形成、光合作用、酶的活化和渗透调节的过程都与钾有关[1-2]。只有在足够高的钾积累条件下生长，烤烟产品才具有更好的芳香味、易燃性和叶片的加工性[3]。但是，对于我国大部分烟草种植区来说，植烟土壤中有效钾含量较低，使得烟叶中的钾含量无法达到全球优质烟叶的标准。根据植烟土壤区划调查结果显示，我国63.1%烟草种植土壤中有效钾含量低于临界水平（150 mg·kg-1），其中极缺钾土壤占19.6%，平均有效钾含量仅为57.5 mg·kg-1，缺钾土壤占43.5%[4]。因此，提高烤烟对钾的吸收和利用效率已成为烟草种植中的一个重要议题。

钾在植物中具有很强的流动性，可以实现地下部到地上部的循环利用，这一功能对植物的电离平衡和能量节省具有重要作用。K+通道基因SKOR和AKT2调控了K+在植物体内的再分布过程，前者在根系的中柱鞘和木质部薄壁细胞中大量表达，介导了K+由地下部到地上部的转运[5]；而后者在根和叶的韧皮部维管系统中大量表达，在韧皮部K+的卸载过程中起主导作用[6]。当植物感知到外部钾亏缺信号时，细胞产生短期和长期响应模式：对于短期响应，AKT1上调表达，细胞质中的钾水平通过液泡向外释放K+来维持；对于长期响应，当胁迫期持续数天甚至数周时，细胞质中的K+浓度降低，会影响植物细胞的代谢过程，依赖于K+活化的H+-PPase 活性被抑制，丙酮酸含量降低[7]。除此之外，植物根系伸长区的细胞伸长亦需要K+产生的细胞膨压。当根土界面钾水平较低时，植株根系形态会发生变化，主根生长受到抑制，根毛生长旺盛，而这种对环境的适应是由和生长激素共同决定的[8]，乙烯在这个过程中充当了低钾胁迫信号转导的信息物质[9]。拟南芥生长素合成基因缺失突变体aux1、axr1、axr2的研究表明，生长素也是根系形态对钾胁迫响应机制的组成部分[10]。

随着研究的不断深入，嫁接技术可提高作物品质、长势和产量，改变品种，提高环境抗逆性和优化异花授粉[11-13]。此外，嫁接技术对提高植物养分吸收也有显著的影响[14-16]。然而，关于嫁接对烤烟钾饥饿耐受性的影响，文献报道较少。因此，本研究希望验证能否通过钾高效基因型烟草砧木嫁接诱导烤烟对钾的胁迫耐受。为了完成这一目的，笔者分析了钾胁迫时下胚轴和根分生组织的净K+流速、不同组织中的钾含量、烤烟生长，以及参与钾吸收和转运的关键基因的时空特征。

1 材料与方法

1.1 供试材料

钾高效基因型烤烟五峰2 号和常规品种云烟87 分别由湖北省烟草公司宜昌市公司和贵州省烟草公司毕节市公司提供。

1.2 试验地点与处理

试验在重庆农科院日光温室进行。为了保证嫁接成功率，砧木种子在接穗种子前7 d 播种。当砧木上出现6～8 片真叶时，选择“劈接”方式进行嫁接处理。当嫁接植株长出新叶后，将植株移栽到水培箱中，每个容器种植12 株幼苗。水培营养液的配方与笔者之前的研究一致[17]。试验过程中，利用压缩机软管向每个水培箱供氧，以保证氧气供应。试验设置了2 个钾水平：+K，正常钾供应水平（5 mmol·L-1）；-K，钾胁迫（0.5 mmol·L-1）。营养液中以K2SO4为钾源，调节不同K+水平。此外，采用4 种嫁接组合[五峰2号（W）、云烟87（Y）、W/Y（W 为接穗，Y 为砧木）和Y/W（Y 为接穗，W 为砧木）]进行试验。8 个处理重复6 次，每个重复12 株，每隔4 d 更换1 次营养液。处理20 d 后，收集植株样品。

1.3 测试指标与方法

1.3.1 植株长势指标 每个处理分别选取4 株烤烟幼苗，对各处理的干物质质量、株高、茎围、根长、叶面积进行测定。选择茎上的倒数第二片真叶进行叶面积测量（LI-3000C,LI-COR,USA）；用电子天平测定烟株的干质量；根长采用WinRhizo Pro 软件进行分析；用皮卷尺测量株高和茎围。

1.3.2 烟株中钾含量的测定 烟草植株在子叶下胚轴被切成2 段。子叶上方为地上部，子叶下方为地下部。采用火焰原子吸收光谱仪测定干样品（Varian AA-220FS,Thermo Fisher Scientific,USA）中的钾含量[18]。

1.3.3 烟株下胚轴横切面K+流速测定 试验开始前，先在+K 水平的处理中选取一半植株使用0.5 mmol·L-1K2SO4进行预处理2 h，以观察各嫁接组合在短期钾胁迫下的表现。将烟草植株从子叶下胚轴处切成2 段，之后胶带分别将地上部和地下部固定于测量液中[0.1 mmol·L-1CaCl2和0.3 mmol·L-12-ethanesulfonic acid（MES）,pH 值为6]平衡30 min。将样品分别放入含有0.5 mmol·L-1K+和5 mmol·L-1K+水平的测量室中。将电极固定在样品横截面的中心，在该试验条件下测定净K+通量20 min，以减小波动引起的变异性。每个样品测量2 次。

每个嫁接组合选取6 株烟株，采用非损伤微测技术（NMT system BIO-IM;Younger Corp.,Amherst,MA,USA）测定其下胚轴横切面的净K+流速[19-20]，用ASET 2.0 （Sciencewares, Falmouth, MA, USA）和iFluxes 1.0 （YoungerUSA, LLC, Amherst, MA, USA）软件记录并转化数据[21]。利用Fick 扩散定律计算净K+流速[22]。

1.3.4 烤烟根系分生区K+流速测定 该试验只涉及烤烟根系对养分离子的吸收。因此，本试验部分处理减少为只有未嫁接的W 和Y 烤烟品种2 个处理，测定部位为根的分生组织。为了阐明K+通道和质膜H+-ATP 酶复合物在2 个烤烟品种中对K+吸收转运的影响，笔者分别使用了原钒酸盐和氯化铯对试验样品进行了预处理（前者为质膜H+-ATP 酶的特异抑制剂，后者为K+通道的阻断剂）[23]，并设置了不使用抑制剂的对照处理。其余测定方法与烟草下胚轴横截面K+流速测定方案一致。

1.3.5 总RNA 的提取与实时定量PCR 使用TRIzol 试剂（Invitrogen,ThermoFisher，USA），根据说明书从各嫁接组合中提取总RNA（根：HAK1 和NKT1；茎：SKOR 和AKT2）。之后，使用RNase-free DNase 去除剩余的DNA 污染。cDNA 第一链的合成体系由1 μg 总RNA、1 μL oligo（dT）18primer、MMuLV reverse transcriptase（TaRaKa, Japan）构成，加水定容至20 μL。按照试剂盒Light Cycler 480 SYBR Green I Master kit 的说明操作，采用实时荧光定量PCR（ABI 7900HT,Applied Biosystems,USA）技术检测目标基因的表达，每个样本分析至少重复3次。采用Primer premier 5.0 软件设计基因特异性引物，所有引物如表1 所示。熔融曲线分析表明，各引物具有较高的特异性。PCR 产物的技术使用2-ΔΔCt方法[24]。

表1 实时定量PCR 分析中使用的引物

1.3.6 数据分析 所有研究数据均以平均值±标准差的形式表示，采用SAS 9.3 版（StatisticalAnalysis System Institute Inc., Cary, NC, USA）进行双因素方差分析，以确定嫁接对烟草的影响，采用邓肯新复极差法对各处理之间的显著性进行检验（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 烤烟植株长势

钾胁迫显著抑制了烟草植株的生长，而嫁接技术则显著缓解了这种抑制作用。对于-K 处理来说，烤烟幼苗全株干质量、株高、茎围、叶面积、根长均显著降低。通过不同砧木的嫁接看出，与W/Y（44.5%）和Y（61.3%）处理相比，钾饥饿导致W（31.1%）和Y/W（32.2%）的干质量减少量较低（表2）。各嫁接处理的株高、茎围、根长、叶面积指标变化的趋势与干质量类似。在正常供钾水平下，W 和Y/W 处理的生长表现明显优于W/Y 和Y 处理，而使用相同砧木的处理则差异不显著（如W 和Y/W 处理）。缺钾条件下，烟草生长趋势与+K 条件下一致。值得注意的是，在钾胁迫下，W/Y 嫁接组合的植株长势明显优于Y 品种，这与+K 条件下这两者之间没有显著差异不同。

表2 不同嫁接组合和钾水平对植株长势的影响

2.2 烤烟植株地上部和地下部钾含量的分布

嫁接同时影响了不同烤烟品种K+的吸收和分布状况。由图1 可见，钾胁迫显著降低了烤烟的整株K+吸收能力，但不同嫁接组合的对烤烟整株K+吸收能力的降低程度不同。在+K 水平下，以W 为砧木的嫁接组合（如W 和Y/W）整株钾含量比以Y 为砧木的嫁接组合增加了97.6%，在-K 水平下，整株钾含量增加了137.76%。值得注意的是，与+K 水平的数据不同，W/Y 的整株钾含量在-K 水平时显著高于Y，而前者没有显著差异。这表明在缺钾条件下，W基因型烤烟品种作为接穗可以提高Y 基因型烤烟对K+的吸收。在-K 处理时，地上部平均钾含量占植株总钾含量的44.3%，比+K 处理高7.3%。此外，在钾胁迫下，烟草整株钾含量的分布由地下部向地上部倾斜的趋势在W 和Y/W 嫁接组合中更为明显。

图1 嫁接组合和钾供应水平对烟草植株钾离子分布的影响

2.3 钾胁迫下烟草下胚轴净K+流速的响应

试验数据表明，当外部环境中钾水平发生变化时，烟草下胚轴横截面K+净流速的上下对比也发生了变化。试验中，由于烟株在子叶下胚轴处被切成2段，这2 个部分横截面的K+流速所代表的的意义不同。地上部横截面通过韧皮部下行的K+流被定义为地上部到地下部的K+流，而地下部横截面通过木质部上行的K+流被定义为地下部到地上部的K+流。由图2 可知，在+K 条件下，烟株下胚轴横截面地上部到地下部平均净K+流速为1 782.72 pmol·cm-2·s-1，是地下部到地上部的1.59 倍。除此之外，各嫁接组合上、下净K+流速无显著差异。为了明确K+在不同钾水平下长距离运输中运动的相对方向，将向下的实时K+流速减去向上的实时K+流速定义为相对K+流量强度。各嫁接组合的相对K+流量强度在+K 条件下的整个测量周期内均为负值，说明在K 供应充足时，烤烟植株的K+有从地上部向地下部迁移的趋势。在-K 条件下，各嫁接组合由地下部到地上部的净K+流速在整个测量周期内是稳定的且差异不显著，但是地上部到地下部的净K+流速却出现了明显的波动状况。以W 基因型烤烟为砧木的处理净K+流速在试验开始后迅速下降，5 min 后逐渐稳定；而以Y 基因型烤烟为砧木的处理净K+流速下降16 min 后才趋于稳定。下胚轴横切面处烟株地上部到地下部的平均净K+流速为373.45 pmol·cm-2·s-1，是地下部到地上部的52.3%。同时，以W 基因型烤烟为砧木的处理地上部到地下部的平均净K+流速显著低于以Y 为砧木的处理。与+K 条件下相反，在-K处理的整个测量周期内，各嫁接组合的相对K+流量强度均为正，说明在钾供应不足时，烟草植株的K+有从地下部向地上部迁移的趋势。

图2 嫁接对烟草下胚轴净K+流速的影响

2.4 钾胁迫对烤烟根系K+获取模式的影响

通过对烤烟根系净K+流速的数据分析，结果发现W、Y2 个烤烟品种对环境低钾胁迫的耐受策略存在显著差异。在正常供钾条件下，W 品种根分生区平均净K+流入速率为549.05 pmol·cm-2·s-1，为Y品种的1.13 倍。当2 个烤烟品种都使用CsCl 进行预处理之后，其平均净K+流入速率与原来相比显著下降，W 品种降低了52.6%，Y 品种降低了37.5%，而且降低后的W 品种平均净K+流入速率显著低于Y 品种。当预处理剂使用原钒酸盐时，2 个烤烟品种根分生区K+净流入量的变化均不显著（图3）。在钾胁迫条件下，所有处理的平均净K+流入速率明显降低，而W 品种根分生区平均净K+流入速率仍然显著高于Y 品种。使用预处理剂后，供试品种的表现与正常供钾条件下不同。CsCl 显著降低了W 品种根分生区平均净K+流入速率，而对Y 品种没有显著影响；原钒酸盐则同时降低了2 个品种的烤烟根分生区平均净K+流入速率，其中Y 品种下降幅度较大，比W 品种下降幅度多15.4%。

图3 不同钾水平条件下烤烟根系分生区的净K+流速

2.5 不同处理K+吸收相关基因的表达水平

qRT-PCR 结果表明，钾亏缺显著改变了烟草植株HAK1、NKT1、SKOR和AKT2 的转录水平。如表3 所示，各处理HAK1 的表达均无明显变化。在钾胁迫条件时，SKOR和AKT2 表达上调，而NKT1 则下调表达。对于不同的嫁接组合，在正常钾供应水平下，以W 为砧木的处理所有相关基因的表达水平显著高于以Y 为砧木的处理。在钾饥饿条件下，笔者观察到类似的情况。然而，在W/Y 处理中，SKOR和AKT2 的表达水平显著高于Y 处理，且不低于W 和Y/W 嫁接处理。这种现象在W/Y 处理的HAK1 和NKT1 中没有出现。

表3 在2 种钾供应条件下，烟草中与钾吸收和转运相关的基因相对表达水平

3 讨论与结论

3.1 嫁接改善了钾胁迫条件下烤烟植株的长势

近年来，嫁接技术已成功用于多种作物应对环境压力和改善矿质养分的吸收，其中包括番茄[25]、西瓜[26]、棉花[15]和黄瓜[27]。然而，嫁接对烟草K 胁迫的缓解作用及其机制尚不清楚。本研究表明，在钾胁迫下，烟草植株生长明显减弱，但钾利用效率较高的砧木嫁接可以缓解这一压力。与W/Y 和Y 嫁接组合相比，W 和Y/W 只略微降低了植株的干质量，株高、茎围、根长和叶面积的变化趋势相似。无论钾水平如何，W 基因型烟草的全株干质量、株高、茎围、根长、叶面积均显著高于Y 基因型。通过嫁接，以W 为砧木的Y 基因型烟草的生长指数接近了W 基因型烟草的水平，显著高于未嫁接的原品种。此外，W 作为接穗对砧木的反馈调节，也提高了W/Y 嫁接组合烤烟的长势表现。在嫁接过程中，这种反馈调控机制通常由长距离信号主导，miRNA 或激素信号均可能作为信号物质发挥作用[28-30]。

3.2 钾饥饿改变了烤烟植株中K+的分布趋势

同一作物的不同基因型在养分吸收和转化方面差异很大。嫁接可以有效利用这一特性，将营养效率高的砧木与目标接穗结合，提高作物品质和产量[31-33]。在烟草方面的研究中，有许多嫁接对多种养分物质吸收产生影响的例子[34,35]。在笔者的研究中，W 基因型烤烟不仅在整株钾含量上优于Y，而且当W 作为砧木时，相对应的嫁接组合钾含量也得到了提高。同时，无论是正常供钾还是缺钾条件下，W 基因型烟草砧木植株的钾含量均显著高于Y 基因型。从植株生长结果来看，与未嫁接的原品种相比，嫁接提高了Y 基因型烤烟全株钾含量。当环境中钾水平降低时，K+在烟草植株中的分布发生了变化。一般情况下，烤烟植株地下部的钾含量通常高于地上部。然而，在缺钾条件下，植株的K+保留在地上部中，而不是将其运输到地下部，这是烟草植株耐受钾胁迫的机制之一。此外，这种趋势在W 和Y/W 嫁接组合中表现得更为明显。当植物幼苗对养分的需求增加时，通过韧皮部到达根系的养分浓度降低，作为反馈信号，根系对养分离子的吸收率提高。同样，当植株对营养物质的需求减少时，韧皮部循环的养分离子浓度增加，抑制了根对相应离子的吸收[36-37]。

3.3 烤烟植株下胚轴和根分生组织横截面的净K+流速分析

K+自根表面横向运输到薄壁组织，通过木质部装载由地下部运输向地上部，又由韧皮部向下循环到根部[38]。K+在韧皮部和木质部的转运受植物各组织中钾水平的调节[39]。试验数据表明，在+K 处理下，经韧皮部向地下部输送的K+流量大于经木质部向地上部部输送的K+流量，在-K 处理下，情况正好相反。这一现象印证了上述关于K+在不同钾水平下在植株体内分布规律的结论。在钾胁迫条件下，当砧木相同，接穗不同时，由地上部向下的净K+流速下降到稳定状态所需的时间相同。当砧木不同，接穗相同时，由地上部向下的净K+流速下降到稳定状态所需的时间不一致（以W 为砧木的处理5 min 就能稳定，而以Y 为砧木的处理需要16 min）。这表明烟草植株在外部环境中钾浓度变化的感觉机制以砧木为主，而非接穗。这种感觉机制主要来自细胞膜电位的变化，细胞膜电位异常敏感，通常在外界环境钾水平下降几分钟内就能观察到[40-41]。研究表明，产生上述电势变化的主要受体有2 种，包括Shaker 家族的K+通道基因(由AKT1介导)和H+-PPase[7]。此外，以W基因型烤烟为砧木的处理净K+流速下降到稳定水平所需的时间小于以Y 为砧木的处理。这表明W基因型烤烟在钾胁迫下可以更快地改变植物体内钾的分布格局，并通过减少向下的钾循环来维持地上部相对较高的钾水平。本研究结果还表明，W 基因型烟草对钾胁迫的快速反应能力能够通过嫁接传递给Y 基因型烟草，使其对钾胁迫耐受性更强。

高亲和转运系统（HATS）和低亲和转运系统（LATS）是植物由根系自土壤界面吸收K+的2 种途径[42]。分析不同钾水平条件下HATS 和LATS 在根系K+吸收过程中分别扮演的角色，对于理解不同基因型烤烟在应对低钾胁迫方面的措施有着重要的意义。试验数据表明，在不添加抑制剂的情况下，W 基因型烟草根分生组织对K+的吸收速率明显高于Y基因型烟草。笔者发现，使用特异性抑制剂后，正常钾水平下2 种烟草砧木K+吸收的主导模式都是依赖于K+通道的LATS。而在钾胁迫下，2 种砧木对K+吸收所依赖的模式则产生了差异。W 品种烤烟根系中依赖于钾转运蛋白的HATS 转运量较大，但与LATS 的差异不显著，说明在钾胁迫时2 种K+吸收体系的地位同等重要；而Y 品种烤烟根系K+吸收模式主要为HATS 和LATS 受到抑制。根系细胞膜电位的变化可以作为植物对缺钾的响应信号，当外源钾水平较低时，质膜超极化激活K+通道；相反，当外源钾水平较高时，质膜去极化。本研究结果表明，W基因型烤烟根系中K+通道蛋白和转运体在应对钾胁迫方面发挥着同样重要的作用，而Y 基因型中只有钾转运体起主导作用。这是2 个烤烟品种K+吸收效率差异的重要原因，同时也是利用嫁接技术提高烤烟K+吸收效率的理论基础，在耐盐南瓜砧木中也发现了类似的结果[43]。

3.4 烤烟钾转运途径相关基因表达分析

K+通道家族[5]、高亲和转运蛋白家族[44]、共转运蛋白家族[45]、反向转运蛋白家族、质子泵供能基因[46]共同参与调控了烤烟K+的摄取和转运过程。HAK1在低钾环境中调控K+的跨膜吸收，是高亲和力K+转运蛋白家族的成员[47-48]。NKT1是烟草细胞内表达的Shaker-like 家族4 种K+通道基因中，介导K+吸收的内向整流K+通道基因[49]。SKOR负责K+向木质部的转运，而AKT2参与K+从合成位点的装载和从贮藏组织的卸载[49]。本研究中，钾供应水平和嫁接处理均影响相关基因的表达。外界钾浓度的变化并没有改变烟草根系中HAK1的表达水平，说明低钾环境并不是诱导HAK1表达的因素。当防御基因表达所消耗的能量不能超过它所带来的积极影响时，植物往往会选择下调这些基因的表达水平[50-51]。NKT1在钾胁迫下的下调表达正好与烤烟根分生组织中净K+流速的研究结果相对应，即在环境中钾水平较低时，K+通道在钾跨膜吸收过程中所起的作用相对下降。钾胁迫下SKOR和AKT2的上调表达表明，烟草通过提高K+在植物地上部与地下部之间的循环效率，降低了钾缺乏对植物生长的抑制作用。值得注意的是，这种调控可以通过信号物质在砧木和接穗之间传递，还需要进一步的研究。

总之，采用烤烟品种五峰2 号砧木嫁接可以提高云烟87 对钾的吸收、转运效率和烟株长势。原因可以归于根系较高的K+吸收能力和地上部较高的循环转运效率，从而使烤烟对钾水平变化的感受信号更为敏感，同时K+在木质部和韧皮部运输能力得到了提升，使烟株在面对钾胁迫时具有更好的耐受性。本研究中出现的接穗与砧木之间反馈调节现象表明，不同基因型烤烟嫁接过程伴随着信号物质的传递。