透明质酸对载药角膜接触镜缓慢释放的研究

2023-12-18单诗琪胡海洋陈大为

中国药剂学杂志(网络版) 2023年6期

单诗琪，胡海洋，陈大为

（沈阳药科大学药学院，沈阳辽宁 110016）

糖尿病性白内障是白内障中的一种病症[1]。常见的治疗方法分为药物治疗[2]和手术治疗[3]两种。随着近年来药学的发展，药物治疗是在早期治疗糖尿病性白内障最为方便、舒适的治疗方法[4]。苄达赖氨酸（Bendazac Lysine, BDZL）是意大利Angelini 公司研制的白内障治疗药物[5-6]，商品名为Bendalia。苄达赖氨酸是醛糖还原酶抑制剂，不仅对糖尿病性白内障有效，还对多种类型的早期白内障有预防和治疗作用。其不良反应微轻，是目前国内外广泛应用的一种确实有效的预防和治疗白内障的药物[7]。目前，市场上已用该药制备成滴眼液[8]。

滴眼液为最常用的眼用药物制剂[9]。但滴眼液因眼部泪膜屏障导致其药物停留时间短，生物利用率低，用药效果不明显。为改进滴眼液的不足之处，国外研究人员提出以角膜接触镜作为眼用药物载体。治疗性角膜接触镜，其制造材料包括硬性透气性材料、软性非亲水性材料和软性亲水性材料等[10]。软性亲水性材料即水凝胶材料[11]。因采用水凝胶材料制成的角膜接触镜佩戴适应期短、舒适感强，深受广大患者欢迎。其治疗途径为[12]：药物从角膜接触镜内释放，穿过角膜，进入虹膜，经过睫状肌，最后作用在晶状体发挥药效。角膜接触镜的加载药物方式一般情况下分为两种。第一种是聚合单体—药物共聚法[13]：将配制好的药物溶液与聚合单体（水凝胶、交联剂与光引发剂）均匀聚合，倒入模具中，紫外固化后形成角膜接触镜。第二种为吸附法[14]：先制成空白角膜接触镜，浸泡在药物溶液里进行吸附。

本文将采用聚合单体—药物共聚法和吸附法制备载苄达赖氨酸角膜接触镜，研究制备处方、工艺对载苄达赖氨酸角膜接触镜的质量影响，并进一步探索透明质酸对载苄达赖氨酸型角膜接触镜中药物释放的影响。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

YS304 紫外/可见分光光度计（辽宁银生科技有限公司），ALC-110.4 电子分析天平（天津赛力斯自动化科技有限公司），KQ5200E 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），XW-80 A 旋涡混合器（上海精科实业有限公司），DF-101 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司），PB-10 普及型 pH 计（赛多利斯科学仪器有限公司），透析袋（MWCO=3500，上海绿鸟），DWS-51 钠离子浓度计（上海仪电分析仪器有限公司），AP-9100A 真空无油真空/压力泵（天津艾特塞恩斯仪器有限公司）。

1.2 试剂

甲基丙烯酸羟乙酯（C6H10O3，分子质量 130.14，HEMA，ρ = 1.073 g·mL-1，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），二甲基丙烯酸乙二醇酯（C10H14O4，分子质量 198.22，EGDMA，ρ = 1.051g·mL-1，分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），光引发剂（C10H12O，分子质量 164.2，Photointiator1173，ρ=1.077 g·mL-1，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），苄达赖氨酸（C22H28N4O5，分子质量 428.48，BDZL，上海毕得医药科技有限公司），透明质酸（C14H22NNaO11，分子质量93000， HA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），氯化钠（NaCl，分子质量 58.44，分析纯，国药集团化学试剂有限公司），氯化钾（KCl，分子质量 74.55，分析纯，国药集团化学试剂有限公司），碳酸氢钠（NaHCO3，分子质量 84.01，分析纯，天津博迪化工股份有限公司），二水氯化钙（CaCl2·2H2O，分子质量 147.01，分析纯，天津博迪化工股份有限公司），磷酸氢二钠（Na2HPO4，分子质量 141.96，分析纯，国药集团化学试剂有限公司），磷酸二氢钾（KH2PO4，分子质量 136.086，分析纯，国药集团化学试剂有限公司），盐酸（HCl，分子质量 36.46，分析纯，天津博迪化工股份有限公司），五氧化二磷（P2O5，分子质量 141.94，分析纯，国药集团化学试剂有限公司），氯化钙（CaCl2，分子质量 110.98，分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法

2.1 水凝胶角膜接触镜的制备

分别精密量取一定体积的甲基丙烯酸羟乙酯（HEMA）、二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA）和光引发剂（Photointiator 1173），置于1 mL 量瓶中，置旋涡混合器上，聚合均匀，加适量水稀释至刻度，即为聚合单体溶液。将聚合单体溶液置于超声清洗器，超声10 min 去除氧气，精密量取 100 μL 聚合单体溶液注入角膜接触镜模具中，置紫外灯 365 nm 处固化，使单体充分反应形成水凝胶角膜接触镜。

2.2 水凝胶角膜接触镜的质量考察

根据国家《眼科光学·接触镜·第3 部分：软性接触镜》相关要求，水凝胶角膜接触镜的质量参数为透光率、含水量、离子渗透率[15]。本研究以上述3 个质量参数为指标，评价水凝胶角膜接触镜的质量，并以此筛选水凝胶角膜接触镜最佳聚合单体配比与紫外固化时间[15]。

2.2.1 透光率的测定

将水凝胶角膜接触镜 CL-W 置于人工泪液（67.8 mg 氯化钠、21.8 mg 碳酸氢钠、13.8 mg 氯化钾、0.8 mg 二水氯化钙置于 1 000 mL 去离子水中溶解，并用 pH 计测其 pH 值为 7.4 ± 0.2）中浸泡 6 h，按照紫外—可见分光光度法测定，在 200～800 nm 的波长处测定透光率。根据国家标准《眼科光学·接触镜·第5 部分：光学性能试验方法》，角膜接触镜透光率应不小于 92%[16]，确定水凝胶角膜接触镜透光率可达到 92% 以上的最佳波长。将不同聚合单体质量配比的水凝胶角膜接触镜 CL-1、CL-2、CL-3 在最佳波长下测定透光率。

2.2.2 含水量的测定

根据 2020 年版《中国药典》，采用减压干燥法测定角膜接触镜的含水量。

取培养皿，加入五氧化二磷干燥剂适量，使铺成 0.5～1 cm 的厚度，放入减压干燥器中。将制备的水凝胶角膜接触镜（湿体），置于已在供试品同样条件下干燥至恒重的扁形称量瓶中，精密称定。将加入角膜接触镜的称量瓶放入减压干燥器中，打开瓶盖，减压至 2.67 kpa（20 mmHg）以下持续半小时，温室放置 24 小时。在减压干燥器出口连接无水氯化钙干燥管，打开活塞，待内外压一致，关闭活塞，打开干燥器，盖上称量瓶瓶盖，取出称量瓶，迅速精密称定重量。

含水量公式：

Water Content 为含水量，%；W1为湿体角膜接触镜的重量，g；W2为恒重称量瓶的重量，g；W3为（称量瓶+干体角膜接触镜）的恒重重量，g。

2.2.3 离子渗透率的测定

将制备的水凝胶角膜接触镜分别放于模具间的圆孔上，用不锈钢夹将水凝胶角膜接触镜固定，分别放置于测量池中。在测量池中加纯净水 180 mL，在标定池中加 0.1 mol·L-1的 NaCl 溶液180 mL。将测量池置于磁力搅拌器上，并将钠离子浓度计的电极插入被测液中，电极底部的玻璃球应距测量池底部 20 mm 以上，待读数稳定后，读取数据，每隔 20 min 测定一次数据, 连续测定 3 次并取平均值。通过公式计算离子渗透率。

离子渗透率计算公式：

Dion 为离子渗透率，cm2·s-1；L 为膜厚度，cm；S 为膜面积，cm2；C0为 Na+初始浓度，mol·L-1；C为测量池中时间t时的 Na+浓度，mol·mL-1；V 为测量池体积，cm3。

2.3 苄达赖氨酸的体外分析方法的建立

2.3.1 配制苄达赖氨酸溶液

精密称取 50.03 mg 苄达赖氨酸（BDZL）置于 50 mL 量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成 BDZL 贮备液（1 mg·mL-1）。

2.3.2 线性与范围

根据 2020 年版《中国药典》，按照紫外—可见分光光度法，苄达赖氨酸在 307 nm 的波长处有最大吸收[18]。

精密量取 BDZL 贮备液 250、375、500、625、750 μL 至 10 mL 量瓶中，稀释至刻度，摇匀，即得到浓度分别为 25、37.5、50、62.5、75 μg·mL-1的 BDZL 对照品溶液。以水为空白，在307 nm 波长处测定各对照品溶液的吸光度，以测得的吸光度与其相应浓度计算线性回归方程，并绘制标准曲线。

2.3.3 溶液稳定性试验

取浓度为 50 μg·mL-1的 BDZL 对照品溶液，分别于 0、2、4、6、8、10 h 各时间点，在 307 nm波长处测其吸光度，计算 RSD%，RSD% ≤ 2.0%，判断其溶液稳定。

2.3.4 精密度试验

同 2.3.1 配制方法制备苄达赖氨酸贮备液，取 6 组浓度为 50 μg·mL-1苄达赖氨酸对照品溶液，在 307 nm 波长处测其吸光度。计算 RSD%，RSD% ≤ 2.0%，确定精密度符合规定。

2.3.5 聚合单体中含苄达赖氨酸准确度的试验

分别精密量取 BDZL 贮备液（1 mg·mL-1）400、500、600 μL，置于 10 mL 量瓶中，分别加入6 mL 的聚合单体溶液，加水稀释至刻度，摇匀，作为各浓度的回收率溶液（40、50、60 μg·mL-1），每种浓度分别制备 3 组。精密量取 BDZL 贮备液（1 mg·mL-1）1 mL，置于20 mL 量瓶中加水稀释至刻度，摇匀，即得到浓度为 50 μg·mL-1的 BDZL 对照品溶液。分别取对照品溶液、回收率溶液在 307 nm 波长处测其吸光度，根据对照品比较法，计算回收率溶液的含量，组内回收率 RSD%≤ 2.0%，组间回收率 RSD% ≤ 2.0%，以确定聚合单体对苄达赖氨酸含量测定是否有干扰。

计算公式：

Cx为供试品溶液的浓度；Ax为供试品溶液的吸光度；CR为对照品溶液的浓度；AR为对照品溶液的吸光度。

2.4 载药角膜接触镜的制备

2.4.1 聚合单体—药物共聚法制备载药角膜接触镜

精密称取 50.04 mg 苄达赖氨酸，置于 10 mL 量瓶中，加水适量溶解并稀释至刻度，配制成浓度为 5 mg·mL-1的苄达赖氨酸贮备液（苄达赖氨酸滴眼液标示量为 5 mg·mL-1）。

精密量取一定体积的 HEMA、EGDMA、Photointiator 1173 置于 1 mL 量瓶中，置旋涡混合器上，均匀聚合，精密量取苄达赖氨酸贮备液（5 mg·mL-1）100 μL 加入含有聚合单体溶液的量瓶中，加水稀释至刻度，即为含苄达赖氨酸的聚合单体溶液。将聚合单体溶液置于超声清洗器超声 10 min 去除氧气，精密量取 100 μL（含苄达赖氨酸 50 μg）的聚合单体注入角膜接触镜模具中，于紫外灯 365 nm 处固化，使单体充分反应，记作 CL-B，形成聚合单体—药物共聚法载药角膜接触镜。

2.4.2 吸附法制备载药角膜接触镜

按最优配比和工艺制备空白水凝胶角膜接触镜。将空白角膜接触镜置于苄达赖氨酸溶液（5 mg·mL-1）中浸泡 24 h，使苄达赖氨酸吸附在空白角膜接触镜的表面，记为 CL-S，为吸附法制备的载药角膜接触镜。

2.4.3 聚合单体—药物—透明质酸共聚法制备角膜接触镜

配制浓度为 5 mg·mL-1的苄达赖氨酸贮备液和浓度为 1、1.5、2、2.5、3、3.5 mg·mL-1的透明质酸溶液。

精密量取一定体积的 HEMA、EGDMA、Photointiator 1173 置于 1 mL 量瓶中，置旋涡混合器上，均匀聚合，即为聚合单体溶液。精密量取苄达赖氨酸溶液（含苄达赖氨酸 50 μg）100 μL 和 1、1.5、2、2.5、3、3.5 mg·mL-1的透明质酸溶液各 50 μL 分别注入含有聚合单体溶液的量瓶中，加水适量至刻度。将各聚合单体溶液置于超声清洗器超声 10 min 去除氧气，各精密量取 100 μL 聚合单体注入角膜接触镜模具中，于紫外灯 365 nm 处固化，使单体充分反应，记作 CL-H1、CL-H2、CL-H3、CL-H4、CL-H5、CL-H6。形成聚合单体—药物—透明质酸共聚法角膜接触镜。

2.5 载药角膜接触镜体外释放

根据 2020 年版《中国药典》，按照紫外—可见分光光度法，用吸收系数法计算载药角膜接触镜中苄达赖氨酸的释放含量[17]。

同“2.4.1”“2.4.2”“2.4.3”制备的角膜接触镜放入透析袋中，置于 50 mL 烧杯中，在烧杯中加入人工泪液 35 mL，放置在磁力搅拌器上进行磁力搅拌使其药物释放。分别于5、6、8、24、48、72、96 h 的时间点取人工泪液 4 mL 置于比色皿中，在 307 nm 波长处测定吸光度。每次测定后再将人工泪液倒回烧杯中。通过公式 1 计算释放浓度。所得浓度通过公式 2 计算苄达赖氨酸释放率。

Cx为药物的浓度，g·mL-1；Content为释放率，%；Ax为药物的吸光度；为药物的吸收系数；100 为浓度换算系数；苄达赖氨酸的为 130[18]；D 为稀释体积；在共聚法角膜接触镜中W为药物取样量，g；在吸附法角膜接触镜中W为空白角膜接触镜的吸附量，g。

3 结果

3.1 水凝胶角膜接触镜聚合单体配比与紫外固化时间的筛选

3.1.1 测定透光率最佳波长的确定

将制备的水凝胶角膜接触镜 CL-W 置于比色皿中，在 650 nm 波长处测定的透光率大于92%，可选择在 650 nm 为透光率测定的最佳波长。结果见图1。

Fig. 1 Transmittance of hydrogel corneal contact lens (n = 3)图1 水凝胶角膜接触镜的透光率（n = 3）

3.1.2 水凝胶角膜接触镜含水量、透光率和离子渗透率的测定

CL-1、CL-2、CL-3 的含水量、透光率和离子渗透率结果见表1。

Table 1 Water content, light transmittance and ionic permeability of CL-1, CL-2 and CL-3 (n = 3)表1 CL-1、CL-2、CL-3 的含水量、透光率和离子渗透率（n = 3）

3.1.3 水凝胶角膜接触镜聚合单体配比与紫外固化时间的确定

筛选出聚合单体溶液最佳处方配比：HEMA 用量 0.863 g、EGDMA 用量 0.043 g、Photointiator 1173 用量 0.015 g，在紫外灯 365 nm 处固化时间为 6 min，形成肉眼可见透明的角膜接触镜。将其在紫外波长 650 nm 处测得透光率为（94.3 ± 0.4）%、含水量为（57.6 ± 0.5）%、离子渗透率为（2.06 × 10-6± 0.06）cm2·s-1。根据国家标准，水凝胶角膜接触镜的透光率不小于 92%、含水量在 49%～70% 之间、离子渗透率不小于 9.7 × 10-10cm2·s-1。该制备出的水凝胶角膜接触镜的含水量、透光率和离子渗透率均符合国家标准。随着聚合单体质量比减小，角膜接触镜的离子渗透率变大。紫外灯固化时间为 3 min 时，角膜接触镜不成膜；紫外灯固化时间为 9 min 时，角膜接触镜变硬易碎裂。水凝胶角膜接触镜外观见图2。

Fig. 2 Appearance of hydrogel corneal contact lens图2 水凝胶角膜接触镜的外观

3.2 苄达赖氨酸的体外分析方法的建立

3.2.1 线性与范围

BDZL 溶液在 25～75 μg·mL-1浓度范围，线性方程：A= 0.0105C+ 0.0384，相关系数R为0.9974，浓度与吸光度线性关系良好。结果见图3。

Fig. 3 Linear relationship of concentration of benzyl lysine solution图3 苄达赖氨酸溶液浓度的线性关系

3.2.2 溶液稳定性试验

BDZL 对照品溶液（50 μg）在室温（约 25 ℃）条件下放置 10 h，每隔 2 小时进行紫外吸光度测定，RSD% = 1.76%，小于 2.0%，说明 BDZL 对照品溶液在 10 h 内均稳定。

3.2.3 精密度试验

6 组 BDZL 对照品溶液（50 μg）吸光度 RSD% = 0.91%，小于 2.0%，表明重复性良好。

3.2.4 聚合单体中含苄达赖氨酸准确度的试验

组内平均回收率分别为 100.7%、101.6%、100.5%，在 80%～115% 之间；组内 RSD 为0.958%、0.248%、0.527%，均小于 2.0%；组间平均回收率为 100.9%，在 80%～115% 之间，组间 RSD为 0.58%，小于 2.0%，表明聚合单体对苄达赖氨酸含量测定无干扰。结果见表2。

Table 2 Accuracy test of bendazac lysine表2 苄达赖氨酸的准确度试验

3.3 体外释药的测定

3.3.1 聚合单体—药物共聚法与吸附法载药角膜接触镜体外释放率的比较

聚合单体—药物共聚法角膜接触镜（CL-B）释药时间累计 96 h，释药率为（91.59 ±3）%；吸附法载药角膜接触镜（CL-S）释药时间累计 48 h，释药率为（99.80 ± 0.2）%。聚合单体—药物共聚法角膜接触镜释放可达到 96 h 持续释放，而吸附法载药角膜接触镜只能在短短 48 h 内释放结束，所以采用聚合单体—药物共聚法制备角膜接触镜，可以使药物持续释放。结果见图4。

Fig 4 Release content curves of CL-B and CL-S (n=3)图4 CL-B、CL-S 释药率曲线（n=3）

3.3.2 聚合单体—药物—透明质酸共聚法角膜接触镜的体外释药

聚合单体—药物共聚法角膜接触镜 96 h 累计释药率为（91.59 ± 3）%。

聚合单体—药物—透明质酸共聚法角膜接触镜，当 HA 浓度为 1 mg·mL-1时，96 h 累积释药率（68.89 ± 5）%；当 HA 浓度为 2.5 mg·mL-1时，96 h 累积释药率小于 50%。通过试验确定聚合单体—药物—透明质酸共聚法角膜接触镜具有缓慢释药的效果。结果见图5。

Fig. 5 Cumulative release curves of CL-B, CL-H1, CL-H2, CL-H3, CL-H4, CL-H5 and CL-H6 (n = 3)图5 CL-B、CL-H1、CL-H2、CL-H3、CL-H4、CL-H5、CL-H6 的累积释药曲线（n = 3）

3.3.3 聚合单体—药物—透明质酸角膜接触镜的外观

聚合单体—药物—透明质酸角膜接触镜，CL-H 组数据表明 HA 浓度增加，含水量增加、透光率和离子渗透率降低；在 HA 浓度为 2 mg·mL-1时，透光率小于 92%。

聚合单体—药物—透明质酸角膜接触镜最佳处方和工艺为：精密量取 0.863 g HEMA、0.043 g EGDMA、0.015 g Photointiator 1173，置于 1 mL 量瓶中，置旋涡混合器上，均匀聚合，即为聚合单体溶液。精密量取苄达赖氨酸溶液（含苄达赖氨酸 50 μg）100 μL 和 1 mg·mL-1的透明质酸溶液 50 μL，分别注入含有聚合单体溶液的量瓶中，加水适量至刻度。将聚合单体溶液置于超声清洗器超声 10 min 去除氧气；各精密量取 100 μL 聚合单体注入角膜接触镜模具中，于紫外灯365 nm 处固化 6 min，使单体充分反应，形成聚合单体—药物—透明质酸共聚法角膜接触镜。

聚合单体—药物—透明质酸角膜接触镜的其透光率、含水量和离子渗透率见表3，外观见图6。

Table 3 Water content, light transmittance and ion permeability of polymeric monomer drug hyaluronic acid corneal contact lens (n=3)表3 聚合单体—药物—透明质酸角膜接触镜的含水量、透光率和离子渗透率（n=3）

Fig. 6 Appearance of corneal contact lens图6 角膜接触镜的外观

4 讨论

4.1 角膜接触镜的透光率、含水量与离子渗透率

水凝胶角膜接触镜，通过制备方式、药物配比筛选确定 HEMA∶EGDMA∶Photointiator 1173的质量比 58 : 3 : 1，透光率、含水量与离子渗透率均符合国家标准。HA 浓度增大使角膜接触镜的含水量增大，透光率降低，说明 HA 影响角膜接触镜的透光率。HEMA 与EGDMA 的增多，会使角膜接触镜离子渗透率下降。

4.2 聚合单体—药物—透明质酸共聚法制备的角膜接触镜

HA 浓度为 1 mg·mL-1时，聚合单体—药物—透明质酸共聚法制备的角膜接触镜在累计 96 h释药率为 70%。相比于聚合单体—药物共聚法制备的角膜接触镜，透明质酸具有缓慢释药的作用。缓慢释放的效果能更好地提高药物的生物利用度，使药物在有效的时间内充分作用于病灶，药物能起到更好的治疗效果。药物选用苄达赖氨酸，对多种类型的早期白内障有预防和治疗作用。在治疗眼部疾病中，加入透明质酸不仅能起到补水、缓解眼部不适症状的作用，还可以减轻并调节眼部炎症问题。其在治疗白内障的药物剂型中能发挥更好的效果。