一氧化氮在牙周炎进展中的作用机制与应用

曲尼色珍,周延民

一氧化氮(nitric oxide,NO)是一种内源性合成的双原子分子,具有自由基特性,存在于人体的各种组织和细胞中,参与调节多种生理和病理过程[1]。NO通常由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)催化L-精氨酸产生[2],其中NOS包括内皮型NOS(endothelial NOS,eNOS)、神经元型NOS(neuronal NOS,nNOS)和诱导型NOS(inducible NOS,iNOS)[3]。牙周炎作为常见的口腔疾病之一,其进展与牙周病原体引起的免疫炎症反应相关[4],其中iNOS的表达使炎症牙周组织中产生高浓度NO。本文将对NO在牙周炎进展及治疗中的作用研究进行综述。

1 NO在牙周组织中的表达

NO是免疫系统和循环系统发挥生理功能的重要调节剂,在人体内少量存在,其生成过多与细胞凋亡/死亡和组织损伤有关[5]。作为一种内皮源性信号因子,由eNOS和nNOS介导产生的低浓度NO在健康牙周组织血管扩张、神经信号传递、成骨细胞分化等生物过程中发挥信使/调节剂作用,并参与疼痛刺激的信号传递[6]。有研究表明,利用NOS抑制剂阻断NO的生成可显著抑制牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)成骨分化并刺激其分化为脂肪细胞[7],并进一步证明NO可能通过JNK/MAPK信号通路平衡PDLSCs向成骨细胞和脂肪细胞分化。

牙周炎症反应过程中,病原体及其释放的外毒素诱导巨噬细胞产生iNOS,催化底物L-精氨酸长时间产生大量NO,参与牙周炎的发生发展[8]。在牙周炎初期,菌群失调使大量中性粒细胞被招募至牙周组织,CD11b表达上调,同时iNOS等促炎因子表达显著增多,高浓度NO作用于致病微生物及其产生的生物膜,发挥抗菌作用[9]。然而,长时间高浓度的NO会过度激活炎症反应,并通过为细菌提供组织分解产物(如胶原蛋白肽和含血红素化合物)等营养物质,引起炎症和微生物菌群失调,两者协同并产生正反馈回路[10],导致牙周上皮破坏和骨丢失。在炎症消退阶段,NO可抑制白细胞黏附血管内皮及中性粒细胞募集[11]。已有研究表明,与健康对照组相比,慢性牙周炎患者龈沟液及唾液中NO水平显著升高[12-14],并且唾液NO水平随着炎症加重而增加。有学者发现,诊断为牙龈炎和牙周炎的患者在进行牙周治疗后,唾液中NO水平降低;未经治疗患者NO表达持续保持在较高水平[15]。因此,NO作为一种生物标志物,可用作检验牙周状态的指标之一。目前已有学者研制出电化学传感平台及荧光探针,以实时监测和准确定量细胞内产生的NO,在牙周炎的早期诊断中极具潜力[16-17]。

2 NO促进牙周炎发展的作用机制

2.1 细胞毒性作用

牙周组织和唾液中的NO是口腔通过非特异性免疫抵抗病原体的一部分。iNOS完全依赖于炎症刺激表达,一旦激活,iNOS会在数小时内产生持续高水平NO:一方面NO可以结合还原血红素a3,与O2竞争,对细胞色素氧化酶产生抑制,同时其反应产物(包括过氧亚硝酸盐、二氧化氮或亚硝基硫醇)可破坏线粒体结构的完整性,使线粒体通透性改变,从而导致巨噬细胞以及周围的牙龈上皮细胞线粒体呼吸链受损,诱导细胞凋亡[18];另一方面NO与超氧化物反应形成的活性氮(reactive nitrogen species,RNS)和活性氧(reactive oxygen species,ROS)可通过脂质过氧化和脱氧核糖中嘌呤碱基、嘧啶碱基的化学改变等途径造成细胞核酸、蛋白质和膜脂质损伤[19],从而抑制牙周病原体的增殖,减轻感染。但局部ROS和RNS产生过量可导致组织内氧化应激,造成结缔组织破坏和牙槽骨吸收,继而引起牙齿松动脱落[20]。

2.2 骨组织吸收

可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylate cyclase, sGC)是NO受体,NO可激活sGC,促进环磷酸鸟苷(cGMP)产生[21-22],从而抑制破骨细胞黏附和酸分泌[23],并增加成骨细胞IL-6表达,促进成骨细胞分化[24]。生理条件下,NO诱导的sGC活化确保了骨吸收和骨形成之间的平衡;而在牙周炎症状态下,β1-sGC被氧化,sGC对NO的敏感度下降[25],从而抑制NO-环鸟苷单磷酸(cGMP)-蛋白激酶G(PKG)途径[26],促进破骨细胞性骨吸收陷窝出现,成骨细胞活性受抑制,骨稳态破坏,并随着牙周炎发展,导致牙槽骨吸收,牙齿松动移位,最终牙齿脱落,咀嚼功能下降。

2.3 软组织破坏

软组织降解主要是由纤维溶解酶和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)等宿主酶引起[27],NO可介导MMP的活化和表达。研究表明,NO的反应中间体过氧亚硝酸盐和二氧化氮可激活中性粒细胞胶原酶(MMP-8),导致牙龈组织中胶原纤维在牙周炎早期严重流失[28]。成纤维细胞在结缔组织更新和伤口愈合中起着关键作用,高浓度NO可抑制成纤维细胞活性,使胶原蛋白合成减少,可能引起愈合受损,导致组织破坏与组织修复的不平衡。这种失衡状态下,牙周软组织破坏增加,牙周膜基质及胶原纤维变性、降解,牙周膜间隙增宽,结合上皮向根方迁移,出现附着丧失形成牙周袋。

3 NO与牙周炎治疗

NO与牙周炎密切相关,低水平NO参与信号转导途径并介导生理过程,可促进血管扩张、参与糖酵解途径调节骨合成代谢,有助于牙周软组织的修复与牙槽骨的重建[29],但高水平NO可产生细胞毒性,促进炎症的进展[30]。近年来,众多学者的研究热点聚焦在NO双向作用上,提出了截然不同的两种治疗策略。一种观点认为可以通过递送NO来实现抗菌抗炎作用[31],另一种则认为应通过抑制iNOS的产生从而降低NO浓度以阻断炎症的进展。

3.1 外源性NO递送

目前,NO供体化合物主要包括硝酸酯类、偶氮二醇烯鎓盐类(NONOates)、S-亚硝基硫醇类(RSNO/SNO)、呋咱氮氧化物类、NO-金属配合物类等,通过水凝胶、微/纳米颗粒、3D打印支架等载体进行外源性NO递送[32]。供体释放NO的持续时间是其发挥抗菌功效的主要决定因素。有研究证实,与瞬时NO浓度相比,供体释放的细胞内总NO浓度对杀死牙周病原体更重要,瞬时NO浓度越低,NO总量越大,杀菌效果越好,细胞毒性作用越小[33]。低剂量NO与抗生素共同作用时,NO通过增加细菌磷酸二酯酶活性,减少细胞内第二信使和生物膜调节剂环二鸟苷单磷酸(c-di-GMP)水平,使细菌恢复浮游状态,提高细菌对于抗生素的敏感性,从而有助于清除细菌生物膜。NO供体与抗生素联合使用已被证明有助于克服与细菌生物膜相关的耐药性[34-35]。但NO的物理性质常影响其在局部应用:①NO半衰期极短,为0.09～2 s(取决于O2和活性生物分子的局部浓度);②NO以“按需”方式合成,并容易通过磷脂膜扩散;③NO在其合成点附近发挥功能,通常迅速扩散,扩散范围仅数百微米[36]。根据这些性质,目前已开发多种NO释放方式,包括结合光活化、电荷切换或细菌靶向基团等,并通过在聚合物框架内封装或偶联NO供体来增加NO的储存和递送。Feura等[37]评估了释放NO的羧甲基纤维素衍生物对浮游状态牙龈卟啉单胞菌和伴放线聚集杆菌体外杀菌功效以及细胞毒性,发现这种释放NO的聚合物浓度为4 g/L时,能够在2 h内将两种细菌活力降低99.9%,反映了NO的强效快速杀菌作用,该聚合物可作为针对牙周病原体的抗菌剂。此外有学者合成GNRs@mSiO2-SNO/ICG纳米粒子[38],在808 nm的近红外光照射下,金纳米棒将光能转化为热能,SNO分子也会被热激活,在牙周炎症部位释放NO,光动力、光热疗法以及气体治疗共同发挥抗菌作用,炎症小体NLRP3和Caspase-1 mRNA表达急剧减少,进一步表明适当浓度的外源性NO递送可以抑制促炎因子的表达。

3.2 抑制iNOS产生

与其他NOS不同,iNOS催化产生NO的效率最高,可以达到其他合酶的1 000倍,主要分布在巨噬细胞等免疫细胞中,参与炎症性疾病的病理生理过程。在牙周炎中,iNOS水平与组织破坏的严重程度成正相关。因此通过调控iNOS活性进而抑制NO释放以干预牙周炎的发展也是主流观点之一。Kim等[39]从铜藻中分离出的天然产物Epiloliolide通过下调牙龈卟啉单胞菌脂多糖激活的NLRP3,抑制了iNOS的表达,降低局部NO浓度,低浓度NO可有效促进人牙周膜细胞的增殖和迁移。有研究表明亚硒酸钠和α-生育酚的联合应用可以显著抑制牙周炎的进展,其中亚硒酸钠通过抑制NF-κB表达来减少iNOS,从而减轻硝化应激造成的牙周组织损伤,同时牙龈组织中CD95的表达受到抑制,CD95作为外源性细胞凋亡途径的重要受体,可能参与牙周病的发病机制[40]。利特库巴宁A(LA)是一种新型异喹啉生物碱[41],LA可以通过NF-κB途径显著抑制脂多糖诱导的炎性巨噬细胞活化,降低iNOS等炎症因子表达。此外,分子模拟对接表明活性LA通过来自N→O基团的电荷与iNOS的GLU 371残基产生相互作用,直接与iNOS蛋白结合,抑制巨噬细胞NO表达,减少NO合成,从而抑制牙周炎进展。一氧化碳也可以作为牙周病的宿主反应调节剂,通过抑制iNOS等促炎因子表达,从而有助于防治牙周病[42]。

4 总结与展望

综上所述,NO在牙周炎进展中具有双重作用。作为一种脂溶性的气体小分子,NO在生理情况下有助于牙龈疼痛的感知、保护组织免受感染,维持牙龈循环的内稳态;病理情况下,菌斑微生物激活iNOS,释放高浓度NO促进细菌裂解、炎症发展及组织破坏。但NO在口腔组织和口腔疾病中的作用机制、双向作用的浓度阈值尚需进一步研究。目前研究证明,在合适的浓度阈值之内,外源性NO的递送有助于抑制牙周病原体的繁殖,介导菌斑生物膜的清除,有助于治疗牙周炎。但当局部NO浓度过高时,抑制iNOS产生进而减少NO产生也可以作为减缓牙周炎发展的有效方法。此外,NO作为一种生物标志物,应用潜力较大,在疾病进展的早期诊断中起着重要作用。随着科技的发展,对牙周组织内中NO的定位定量检测将成为现实,届时可以根据局部NO的浓度实现牙周炎早期诊断、及时治疗的目标,以达到延缓炎症进展,促进组织再生目的。