新型镁合金黏膜刺激性、急性全身毒性及抗菌性能研究

储茂然,刘 娟,修朝博,孙 宇

镁基合金作为一种新型生物医用金属,其压缩屈服强度和弹性模量比其他常用的金属生物材料更接近天然骨骼,被誉为新一代“革命性医用金属材料”。而且其具有良好的骨诱导性能、抗菌性能以及生物降解性,目前被应用于骨科固定螺钉、接骨板、骨充填材料的多孔支架及缝线等方面,也被应用于血管支架及口腔等领域[1-6]。Mn-3Sn-0.5Mn作为一种新型镁合金在口腔领域中有巨大的应用潜力。本研究将通过金黄地鼠急性全身毒性实验和小鼠黏膜刺激实验评价该镁合金的生物相容性,通过体外抗菌实验和扫描电镜的观察,探究其抗菌性能。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

1.1.1 实验动物 14只60～70 d鼠龄的金黄地鼠,颊囊黏膜完整健康,雌雄均可;纯系昆明种小白鼠14只,体质量20～25 g,雌雄均可。均购自辽宁长生生物技术股份有限公司。所有动物实验均经过哈尔滨医科大学附属第一医院伦理委员会批准(编号:2021059)。

1.1.2 实验材料 黏膜刺激实验组将Mg-3Sn-0.5Mn合金线切割成直径5 mm厚1 mm的圆片,牙胶加热后充填入直径5 mm厚1 mm的模具中固化后获得阴性对照组试件,用牙科高速手机在各试件上制备间距1 mm孔径1 mm的圆孔;抗菌实验组将镁合金线切割成直径6 mm厚1 mm的圆片(Mg-3Sn-0.5Mn镁合金由哈尔滨工程大学提供),对照组316不锈钢(江苏鸿辰金属制品有限公司,中国)规格同上。镁合金及316不锈钢均用1 000目和2 000目SiC砂纸打磨,经丙酮和无水乙醇超声荡洗,环氧乙烷消毒后备用。抗菌实验试件使用前经紫外线灯每面照射1 h后立即使用。LB琼脂培养液(北京保藏生物科技,中国)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)菌株及大肠埃希菌(Escherichiacoli,E.coli)菌株(哈尔滨医科大学附属第一医院微生物教研室提供)。

1.1.3 实验仪器 Tescan离子双束电镜(Tescan有限公司,捷克);电热恒温培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂,中国);超声波清洗机(深圳云奕科技股份有限公司,中国);生物安全柜(苏州赛默飞世尔仪器有限公司,中国);组织切片机(莱卡,德国);光学显微镜(莱卡,德国)。

1.2 实验方法

1.2.1 黏膜刺激实验 以镁合金为实验组,牙胶作为阴性对照组,对侧作为空白对照组。参照YY/T0 127.13—2 018的标准[7],将14只健康金黄地鼠随机分成2组,每组7只。腹腔注射麻醉后将其仰卧位固定,颊囊黏膜及面部皮肤消毒,铺巾。将实验试件缝合于地鼠颊囊内黏膜表面,使试件与黏膜组织保持紧密接触且无压迫,缝合贯通颊囊组织全层,口外打结。术后14 d处死动物,取出材料后对接触的局部组织进行大体及组织学观察。

1.2.2 急性全身毒性实验 根据GB/T 16886．11—2011[8],按照浸提介质与试件表面积为3 cm2/mL的比例在37 ℃恒温水浴锅中浸提72 h,以0.9%生理盐水作为浸提介质,0.22 μm滤膜滤菌后121 ℃高压灭菌0.5 h,放置于4 ℃冰箱保存备用。14只小白鼠分为2组,每组7只。实验组为镁合金组,对照组为生理盐水,尾静脉注射浸提液,速度不超过0.1 mL/s,每只小鼠注射剂量为50 mL/kg。注射后即刻、4 h、24 h、48 h和72 h观察小鼠的状态及其是否出现毒性表现,同时对小鼠在注射前与注射后24 h、48 h及72 h的体质量进行测量,比较体质量的变化。

1.2.3 体外抗菌实验 以镁合金作为实验组,316不锈钢作为对照组。将实验材料置于12孔板中,用LB培养液将S.aureus及E.coli菌液浓度调整为1×106CFU/mL后,每孔加入3 mL菌液静置于37 ℃细菌培养箱中。菌液与样品共培育1 d和3 d后,收集样品表面黏附菌及培养基中游离菌并各自测定活菌数。在2 mL EP管中加入1 mL PBS,将样品放入EP管中180 W超声振动5 min,然后用所得的细菌悬液计数黏于样品表面的活菌。将孔板中菌液吹打均匀,用所得的细菌悬液计数培养基中游离活菌。逐级稀释后,取菌液用涂布平板法涂于LB培养皿表面,37 ℃恒温培养24 h后拍照、计数。通过以下公式计算抗菌率:R=(B-A)/B×100%,其中R是抗菌率,A为实验组菌落数的平均值,B为对照组菌落数的平均值。

1.2.4 扫描电镜观察实验 将材料置于12孔板中,用LB培养液将S.aureus菌液浓度调整为1×106CFU/mL后,每孔加入3 mL菌液静置于37 ℃细菌培养箱中。菌液与样品共培育1 d和3 d后,PBS溶液冲洗后固定,梯度乙醇脱水,自然风干,喷金观察。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 黏膜刺激实验

大体观:实验组与对照组实验动物颊囊黏膜均未出现糜烂、出血、脓肿及结痂等异常表现。组织学观察:阴性对照组及空白对照组中黏膜组织分层清晰,角化层较厚,未见棘层增生,固有层未见炎性细胞浸润(图1)。实验组与阴性对照组及空白对照组相比未见明显异常。结果表明镁合金样品对地鼠颊囊黏膜无刺激性。

A:Mg-3Sn-0.5Mn组;B:阴性对照组;C:空白对照组

2.2 急性全身毒性实验

在72 h观察期内,实验组与对照组动物均未出现任何异常表现,无实验小鼠死亡,且实验组和对照组动物体质量均逐渐增长,体质量变化无统计学意义(P24 h=0.590,P48 h=0.257,P72 h=0.558,均大于0.05)(表1)。

表1 急性全身毒性实验动物体质量变化表

2.3 抗菌实验

共培养1 d和3 d实验组黏附菌和游离菌的菌落数明显少于对照组。各组P均小于0.05,抗菌效果明显(图2～3、表2)。

表2 菌落中位数及统计值表

第一行实验组,第二行对照组

第一行实验组,第二行对照组

共培养1 d的S.aureus的黏附菌抗菌率为57.08%;游离菌抗菌率为45.74%;共培养3 d的S.aureus的黏附菌抗菌率74.99%,游离菌抗菌率为85.65%。

共培养1 d的E.coli的黏附菌抗菌率为81.73%,游离菌抗菌率为74.50%;共培养3 d的E.coli黏附菌抗菌率为98.96%,游离菌抗菌率为99.62%。抗菌效果明显。

扫描电镜观察:镁合金表面3 d的黏附菌明显少于1 d,与对照组相比黏附菌数量明显较少(图4)。正常金黄色葡萄球菌呈圆球状,镁合金表面1 d组表现为皱缩状,3 d组皱缩状更为明显(图5)。

图4 两组表面S.aureus黏附情况

图5 镁合金表面黏附的S. aureus的形态

3 讨 论

生物医用材料是用来对生物体进行诊断、治疗、修复或替换其病损组织、器官或增进其功能的材料。生物医用材料因其在用途上的特殊性,所以对其生物相容性方面要求更加严格。在应用于临床前要经过细胞实验、动物实验及临床前研究等体内外的研究评价该材料的生物相容性。

前期课题组通过对固溶处理(T4)、轧制、挤压等不同工艺加工的Mg-3Sn-0.5Mn合金进行了组织结构及性能的对比,结果表明挤压态Mg-3Sn-0.5Mn晶粒发生了细化,其强度及延伸率也明显提高,同时血液相容性也表现良好;电化学实验及浸泡实验表明挤压态Mg-3Sn-0.5Mn合金表现出更好的耐腐蚀性。所以在此基础上,选择挤压态Mg-3Sn-0.5Mn合金进行兔股骨骨干及背部肌肉的植入,研究其体内生物相容性及降解性能,结果表明该镁合金具有较好的体内生物相容性[9]。但对于该镁合金的急性全身毒性、黏膜刺激性及抗菌性能尚未研究,所以我们对于这些性能进行研究,更加全面地对Mg-3Sn-0.5Mn合金作出评价。

黏膜刺激实验是评价短期或长期接触口腔组织的口腔医用材料是否具有黏膜刺激性的实验方法。本实验选择金黄地鼠作为实验动物,是由于其颊囊中腺体组织和淋巴组织较少,有利于切片观察黏膜组织的改变,同时将实验材料缝合于颊囊,不会影响实验动物的进食,能更好地模拟口腔环境。本实验结果显示实验组与对照组大体下观察均未出现水肿、糜烂等异常表现。组织学观察实验组及阴性对照组与空白对照组相比无明显差异,HE染色均表现为黏膜分层明显,角化层较厚,无棘层增生,固有层无炎性细胞浸润。

急性全身毒性实验是将材料的浸提液灭菌后经静脉直接注射入动物体内,并在观察期内观察其一般表现及毒性反应,从而对实验材料是否具有急性全身毒性作出评价[10]。实验动物多为大白鼠和小白鼠。小白鼠因其容易饲养,繁殖速度较快,体型小容易控制,有明确的质量标准且价格相对便宜,所以是急性、慢性及亚急性毒性实验的首选[11]。本实验通过小鼠尾静脉注射的方式给药,实验组与对照组观察期内均未出现任何毒性反应,两组小鼠体质量均逐渐增长,体质量增长无差异(P>0.05)。表明Mg-3Sn-0.5Mn无急性全身毒性。

Mg-3Sn-0.5Mn合金表现出较好的生物相容性可能归因于不含Ni、Cr等高致敏性元素,Mg元素是人体内第四丰富的矿物质,Mg主要存在于细胞内充当富含能量的三磷酸腺苷(ATP)和核酸的反离子。镁是300多种酶系统的辅助因子,这些酶系统调节体内各种生化反应[12];Mg大部分在小肠处被吸收,多余镁通过肾脏或是粪便排出,具有良好的生物相容性[13]。Mn为人体必需的元素,参与多种酶的合成,适当的Mn水平可以促进骨骼的生长发育,改善机体的造血功能[14]。同时Sn也是公认的具有较好生物相容性的合金元素[15]。

本实验通过体外平板法测定其抗菌性能,同时还通过扫描电镜观察细菌的黏附情况及细菌的形态,更全面地对镁合金的抗菌性能作出评价。实验结果表明该镁合金对于金黄色葡萄球菌及大肠杆菌都具有较好的抗菌作用,同时扫描电镜观察到黏附菌的形态发生改变,共培养3 d后细菌形态较1 d组皱缩更为明显。镁合金的抗菌机制尚不明确,有研究表明可能与局部的pH值的变化有关[16],也可能是高浓度镁离子产生较大的渗透压破坏细胞壁,而产生了抗菌的作用[17]。但有研究表明镁合金在体外表现出良好的抗菌性能,与pH值的增加有密切的关系,但在动物体内却没表现出令人满意的抗菌能力,可能与体液强大的缓冲能力导致pH的变化减小,同时镁合金表面形成碳酸盐/磷酸盐沉淀物,使其降解速率减慢,该层沉淀物还有利于细菌的附着等因素有关,从而导致镁合金在体内的抗菌性能减弱[18-20]。所以对于Mn-3Sn-0.5Mn合金的体内抗菌性能还需进一步研究。

综上所述,新型镁合金(Mg-3Sn-0.5Mn)无急性全身毒性及黏膜刺激性,具有良好的生物相容性,体外抗菌性能明显,可初步满足作为口腔医用材料的基本要求。