小鼠骨髓细胞微核实验教学改革的探讨与实践

余红民 王婷 李静 李远宏 杨向东

小鼠骨髓细胞微核实验（micronucleus test，MNT）是毒理学实验教学中的一门重要实验课程，旨在通过此实验熟悉和掌握微核实验原理及检测方法，并启发科研思维。目前，无论是传统人工操作方法，还是基于流式细胞仪的自动化分析方法，都存在操作过程复杂、重复性较差的问题[1]。实验教学作为高等教育内涵式发展和学生能力培养的重要手段，孕育着科技竞争力，是加快科技创新的“垫脚石”，越来越引起教育工作者的重视。实验教学是人才培养的重要环节，让学生学会带着问题思考，并将问题在实践中得以解决，不仅可以培养学生通过实现目标来获取一定的技能和方法，还能够进一步开发和提高学生的探索能力和求知欲望[2]。小鼠骨髓细胞微核实验教学改革的目标是通过深化直观性、实践性、探索性、启发性、综合性为一体的实验教学内涵，让学生从实验过程中体验失败、获取成功，充分培养学生自学能力、创新能力、反思能力和变通能力，使学生能迅速适应未来工作需求，或快速衔接研究生的科研实验。

1 小鼠骨髓微核实验教学现状

微核试验是检测受试物引起的染色体断裂或有丝分裂器损伤的一种遗传毒性试验方法。微核（micronucleus，MN）是细胞分裂过程中未能进入子细胞参与子细胞核的形成，游离于细胞质中形成的小核。它可以是整条染色体，也可以是染色体断片，圆形、椭圆形或不规则形，直径小于细胞核的1/3。自然状态下生物体产生微核的概率很小，但当有害因素损伤真核细胞的遗传物质时，细胞核中的染色体会发生断裂，当细胞进入下一次分裂时，这些染色体片段不能随有丝分裂进入子细胞，而留在细胞质中就构成了微核。部分研究认为微核试验具有方法简便、易于操作、试验周期短、终点明确、结果稳定、重复性好、可信度高等优点[3-4]，在环境监测、辐射损伤、化学诱变、肿瘤形成和新药及各种化学剂评价等诸多领域有着广泛的应用[5-8]。微核实验是许多国家和组织规定的食品添加剂、药品添加剂、化妆品等化学物质进行遗传毒性检测的必不可少的实验之一，是一种应用广泛的遗传毒性实验方法[9-12]。微核实验可以作为综合监测网络中的毒理学指标之一[13]。本学院毒理学教研室采用的实验方法参照中华人民共和国国家标准（GB15193.5-2014）。从开设这门实验教学课程至今，一些关键问题需要引起重视，主要涉及以下几方面。（1）实验过程中存在的安全问题。例如：小鼠咬伤的应急处理；实验过程中如何正确使用甲醇、环磷酰胺、染色剂、二甲苯等有毒有害化学物质，及这些有毒有害化学物质的回收；显微镜的安全使用等。（2）实验动物伦理教育欠缺和实验动物相关福利不够重视。学生在实验过程中存在观看小鼠间打斗为乐、取笑出现各种实验症状的小鼠、随意丢弃小鼠尸体等不尊重实验动物生命价值的行为。（3）实验的可重复性较差。主要涉及实验过程中骨髓涂片或推片的质量、染色效果、实验结果中嗜多染红细胞与成熟红细胞比值，以及微核计数。（4）课程思政的融入不够。存在教师思政理论知识储备不均，思政教育的渗透参差不齐的现象。（5）存在学生实验习惯有待提高，综合素质有待加强，创新性不足的现象。（6）学生为了获得较高实验课成绩，随意篡改实验结果或者抄袭、挪用其他同学实验结果。

2 小鼠骨髓微核实验教学改革建议

2.1 建立详细、准确的安全方法和程序

高校实验室是学生学习的重要场所。然而，实验室具有一定的危险性，包括化学安全、生物安全、仪器使用安全、防辐射安全、水电安全、技术安全和网络安全等等，可能会导致事故的发生，危及使用者的安全，特别是学生的安全。在实验教学中，实验安全一直被提及，但是大多数学生们只专注于实验本身，不能将实验安全放在足够重视的高度，经常会犯这样或那样的错误，可能对自身、他人或环境等安全问题产生潜在危险，这种情况也是很多实验室的共性问题[14]。足够安全的实验环境是进行实验教学课程的首要保障，也是所有与实验相关人员生命安全的保障。因此，需要建立有效的实验安全教育体系，针对不同的实验教学课程应该具有特异性的实验安全教育方法。小鼠骨髓细胞微核实验需要建立详细、准确的安全方法和程序。学生在实验过程中，要集中精力，认真听讲，服从教师的指导，不随意窜动，不说笑打闹，不做与实验无关的事情。学生在离开实验室前，要注意保持场地清洁、整齐，用过的试剂和耗材要摆放整齐。学生在离开实验室时，要关好门窗，检查仪器、设备是否处在安全状态，切断电源，确保安全后方可离开。

安全管控包括以下四个步骤：识别危险、评估灾害的风险、将危险降到最低、做好应急准备[4]。危险是潜在的危险或伤害的来源。许多化学品有其固有的危险特性，而且这些危险特性是不会改变的。例如，小鼠骨髓细胞微核实验中使用的环磷酰胺是一种细胞毒性药物，临床上用来治疗恶性肿瘤和免疫抑制，但它同时属于I类致癌物，可通过呼吸道、皮肤、消化道等途径影响人体正常细胞的生长和发育[16]。遇到此类化学试剂，学生会面临一系列相应的安全问题：配制一定浓度的环磷酰胺时该如何做好个人防护；在给小鼠注射环磷酰胺时如何操作可以避免接触到环磷酰胺溶液；以及操作完成后剩下的环磷酰胺要如何进行回收和处置等问题。教师需要针对诸如此类问题制作出详细、准确的安全防护方法，作为教学实验课中的重点内容进行强化，并让这些安全知识走进教材里，走进实验教学知识考核体系里，使安全意识有参照、有考察指标。

2.2 进行实验动物伦理再教育

学生在学习小鼠骨髓细胞微核实验时大多处于大三年级，此前或多或少接触过实验动物伦理相关知识，但是在实验教学中部分教师一般只重视实验技能的训练和实验方法的传授，导致学生在思想认识上只是将实验动物作为实验工具，而没有足够认识到实验动物的生命价值，因而存在学生对实验动物伦理准则认识不足的现象。在上实验课时，存在学生不尊重实验动物生命价值的行为。在实验动物的使用上一定要循序遵循减少（reduce）、替代（replacement）、优化（refinement）的“3R”原则。该原则鼓励为实现科学目标而使用最少数量的动物（减少），使用足够的非动物替代动物（替换），减少动物的伤害和痛苦（优化）。减少是以提高效率的方式来适用于每个实验方案。本教研室使用的昆明小鼠来源充足，主要由徐州医科大学实验动物中心提供。在领取实验小鼠时，一定要计算好使用数量，提高使用效率，不浪费实验动物。替代和优化的目的是避免或减少动物的应激反应、痛苦和伤害。动物保护主义者认为，动物也拥有与人类相同的生命和感觉，生命和感觉是天赋权利的基础。所以，动物的权利也应当受到保护，给动物带来痛苦的行为就是恶的行为[17-18]。因此，学生在上小鼠骨髓细胞微核实验课时，教师应当再次让学生接受伦理关怀的学习、教育和培训，做到尊重和善待动物生命，防止针对动物野蛮行为的发生，自觉遵守动物实验操作的伦理准则，并倡导学生成为实验动物伦理的宣传者。

2.3 探索操作标准，提高实验可重复性

本实验采用哺乳动物红细胞微核试验国标方法，阳性对照物用环磷酰胺40 mg/kg 经口或腹腔注射（首选经口）给予。经过多年学生实验发现，阳性对照物制作结果每年都有很大差异。国标中推荐使用7～12 周龄，体质量25～35 g 的小鼠，实际操作中，阳性对照物会受鼠龄、小鼠体质量和环磷酰胺给药浓度的影响而变化。科学研究者推荐用流式细胞仪检测小鼠外周血微核的方法代替常规显微镜检小鼠骨髓微核的方法，因为流式细胞仪计数比手工显微镜更快速和客观。但是，在学生实验中，为了让他们掌握基本的试验方法和技术，降低教学成本，手工显微镜检测方法仍然是高校实验教学主流。小鼠骨髓细胞微核实验过程中骨髓涂片或推片的质量、染色效果、嗜多染红细胞与成熟红细胞比值和微核计数的重复性一直较低。因此，学生实验教学中这种结果可重复性低是实验教学亟待解决的重要问题。

实验结果的可重复性说明研究实验不是偶然发生的特殊状况，而是具有规律性与可验证性的科学规律。可重复性很重要，因为它构成了可靠和预测性科学知识的基础，这与科学的理论和实用目标有关。由于不可重复的实验结果占有率为50%～90%，这些问题似乎在动物模型研究领域最为突出[19-20]。如果大多数实验结果的重复性很低，这在很大程度上可以归因于较低的统计阈值、对好的实验结果的各种偏见以及实验设计和实践的显著可变性。详细的方案可以采用消除偏差的方法，用强有力和独立的统计分析和/或盲法研究避免数据分析中有害偏差。因为有充分的证据证明，积极的实验结果更容易被接受，这意味着实验者不太愿意解释为什么他们的操作可能不那么准确。数据可重复性问题的可能解决方案包括更科学的实验设计、更好的统计，以及最重要的是：良好的指导。良好的指导还意味着向学生传授良好的实践技能[21]。另外，错误的实验方法也是缺乏可重复性的一个主要原因。因此，教师需要在实验设计、实验方法、统计上探索出一套有效的操作标准，并采取良好的指导方式，来提高实验结果的可重复性。

实验过程中学生制作的骨髓涂片或推片时存在大小不等、厚薄不均、长短不齐、细胞分布不均等问题，影响显微镜下细胞观察和计数，给实验结果带来了很多不确定性。实验教材和国标中只提示“常规涂片”，教师可明确要求骨髓片厚薄适宜，有头、体、尾，细胞分布均匀，长度为（1.5～ 2）cm×3 cm，且尾部为弧形，上下缘整齐。缓冲液PH 值、Giemsa 染料质量、染色时间和染色温度对细胞染色效果有重要影响。每一步都制约着细胞核和细胞浆的着色，从而影响细胞和形态的辨认。实验教学时间有限，教师和实验人员需要仔细摸索出针对本实验室环境的最佳染色条件，控制缓冲液PH 值和染料的质量，根据涂片或推片的厚度和室温调整染色时间，总结出一套固有的骨髓片染色操作方法。观察骨髓涂片要按照肉眼、低倍镜、油镜三个步骤进行。肉眼观察涂膜或推膜的大小、厚薄，低倍镜用来浏览全片，观察涂片或推片的质量及染色效果，油镜用来观察细胞分布和形态，计数嗜多染红细胞、成熟红细胞和微核数量。因此，教师在上课时需明确指导学生，要将这些影响结果可重复性的关键点压实、讲透。

2.4 挖掘课程思政元素，无缝衔接融入实验教学

毒理学小鼠骨髓细胞微核实验课程旨在传授知识、培养能力、塑造价值。在该原则的指导下，可以结合微核实验课本身的内容特点、应用价值和对学生就业的需求，挖掘出本课程的思政元素：（1）树立生命至上，爱护和尊重动物生命价值的责任感。（2）培养学生崇尚科学、严谨求实、大胆创新的优良作风。（3）加强学生实验室自我安全防护意识和安全行为规范意识。（4）培养学生自主探索和合作学习的能力。

挖掘课程思政元素，无缝衔接融入实验教学，这就需要教师以“上好一堂思政课”为主阵地，以讲好“三个故事”为着力点，细致入微地寻找中华传统、红色革命、社会主义先进文化中的思政素材，跟学生讲事实、讲形象、讲情感、讲道理。譬如，在本实验教学设计中，倡导尊重和爱护人和动物的生命，可以引用明代动物学家李苏著的《见物》一书，书中指出“猛兽吃人的时候，人们非常痛恨，可是人常年猎食猛兽，猛兽又作何感想？如果猛兽有灵性的话，恐怕也要把人视作禽兽”；倡导学生崇尚科学、严谨求实、大胆创新，可以讲述李四光、钱学森、华罗庚、邓稼先、叶笃正等全身心投入新中国建设的事例；倡导学生自主探索和合作学习，可以联系大庆油田的发现、“解放牌”汽车的研制成功、“东方红一号”人造卫星发射成功、北斗卫星导航系统的研制成功、5G 领跑世界等科技成就的取得。在具体实施中要不露痕迹，逐步引导，有的放矢，相互渗透。

2.5 注重学生综合素质的培养，激发创新思维

实验课是一种理论与实践、知识与能力相结合的教学活动，也是一块“试金石”，可以检验出学生已经养成的行为习惯和价值观念。在小鼠骨髓细胞微核实验课上，使用流水冲洗染色后玻片，有些小组使用完后忘记及时关闭水龙头；有些学生使用显微镜观看染色片时，动作粗暴，过分推拉；有些学生在实验课上自己全程不动手，只在旁边观看同学动手操作；有些学生做完自己的实验后，不管不问，立马就离开。这种种行为习惯的背后体现了个人的综合素养。教师要在实验课上对学生考勤、课堂参与、学习态度、行为习惯、配合教师教学等涉及学生综合素质方面的表现进行指导，并实时监督每位学生的实际动手操作能力，详细记录每位学生参与实验的表现情况，课后针对学生出现的问题给予详细的引导和建议。

培养学生的科学素养最关键的是要提高学生对科学的兴趣、激发创新思维。虽然小鼠骨髓细胞微核实验课作为教学实验课对学生科学素养要求不高，但是如果能将创新性科研意识引入该实验课程，那么不但能为学生埋下科研兴趣的种子，激发学生创新性思维，也能提高教学效果和教学质量。实验课和科研应该互相渗透，教学中有科研，科研中有教学，优化教学内容，培养学生学以致用的能力和实际操作技能。细胞微核实验在科研上应用广泛，教师可以在实验课上将该实验的国内外进展、学术前沿等学术动态展示给学生，也可以将自己在科研实验中的有关探索和假设拿出来学生们探讨。将科研知识渗透到具体的实验教学中去，不但能开拓学生的视野，激发学生的探索欲，提高学生做事热情，又能扩大学生的知识面，形成科学教养，培养学生的综合素质，还能开拓学生的创新思维，提高解决问题的综合能力。

2.6 尊重实验结果，培养学生实事求是的科学态度

陶行知先生提出：千教万教教人求真，千学万学学做真人。对于科学实验，要尊重事实、追求真理。上一节实验课不仅仅是为了让教师完成教学任务，实验过程中环境的差异、人为的差异是探究科学真相无法避免的。要让学生认识到差异的合理性，尊重差异，积极探索差异背后的实事和真相。实验结果是否理想不应该成为实验课成绩的主要得分项。教师要给学生传达的信息是：在实验操作中，如实记录实验现象，不论实验结果如何，都要将真正观察到和得到的结果记录下来；实验结束后，针对实验过程和实验结果中不同的现象和结果分组进行分析讨论，无法解释原因的可以和教师一起探讨，全面分析、总结实验中的不确定性因素。例如，学生在小鼠骨髓细胞微核实验中油镜观察细胞时，有的组嗜多染红细胞与成熟红细胞比值相当高，有的组比值很低，甚至都很难找到嗜多染红细胞。当学生们在油镜中找微核时，有的组计数微核数量很多，有的组可能一个微核都没看到。此时，学生们可运用现有的知识进行分析判断，查找原因。有些问题学生经过这一步自己就找到原因，他们会总结得出，嗜多染红细胞与成熟红细胞比值很高可能是因为有的染色片脱色不彻底导致，嗜多染红细胞与成熟红细胞比值低可能是因为染料加少了或者脱色时间太久的原因。确实有些问题靠一次短暂的实验课是无法解决的，比如说有的学生将染料当成微核进行计数。学生们无法自行解决的这些问题可以汇集到教师手中，教师可以引导式提问，例如，问学生观察到的微核都是什么形态的？是从哪些细胞观察到微核的？微核都处于细胞的哪些位置？让学生思考微核的形态特征是不是和看到的一致。从实验本身出发，综合评定学生，除了考查学生实验操作的掌握情况，更重要的是让他们时刻抱有科学的态度，实事求是，尊重实验结果，遇到问题能全面进行分析，找出问题关键所在。

3 结语

小鼠骨髓细胞微核实验是毒理学中的重难点实验课程，其在科研和临床上应用十分广泛。但是，实验过程中存在安全问题、实验动物伦理教育重视不够、实验可重复性差、课程思政融入不足、学生实验习惯不好、随意篡改实验结果等问题。教师可以通过安全管控；实验动物伦理再教育；探索操作标准，提高实验可重复性；挖掘课程思政元素，无缝衔接融入实验教学；注重学生综合素质的培养，激发创新思维；尊重实验结果，培养学生实事求是的科学态度等一系列举措，来实现小鼠骨髓细胞微核实验的改革。以上这些改革举措相辅相成，相互融合，可为学生适应将来的科研或工作打好坚实基础。