L和C波段微波复合暴露对大鼠认知功能和海马树突棘结构的影响

马丽贞， 梁梦蕊， 邹 勇， 智维佳， 乔 楠， 王 阳， 胡向军， 王丽峰

(军事科学院 军事医学研究院辐射医学研究所， 北京 100850)

0 引言

微波是一种高频电磁波，随着经济与科学发展，已广泛应用于科研、医疗、工农业生产等领域，因而成为新的环境污染源而倍受各国学者的广泛关注[1-2]。有研究表明，微波辐射最敏感靶位之一是脑组织，即微波辐射可以引起学习和记忆能力的改变，其效应主要表现在空间学习和记忆障碍，但其具体机制尚不明确[3-4]。目前，关于微波辐射生物效应的研究，大多采用单一波段微波照射，而人类真实生活与工作环境中，往往是多种频率电磁波的复合暴露[5]。近年来陆续开展了微波复合暴露的生物学效应研究：Tan S Z和Zhu R Q等研究发现，S波段和L波段平均功率密度5 mW/cm2或10 mW/cm2微波复合暴露6 min对Wistar大鼠认知和记忆功能的影响，较单一波段微波暴露明显[6-7]；朱睿卿等发现，平均功率密度5 mW/cm2或10 mW/cm2的L和C波段微波复合暴露大鼠6 min，可致认知功能损伤及海马组织结构损伤、能量代谢改变，且损伤与辐射剂量成正比，复合暴露重于单一暴露[8]。姚传福等采用平均功率密度为3 mW/cm2或15 mW/cm2的X和S波段微波复合照射C57BL/6N小鼠6 min，发现微波复合暴露可造成机体免疫功能紊乱，且与复合暴露剂量呈正相关[9]；董霁等发现，平均功率密度为10 mW/cm2的S和X波段微波连续复合暴露大鼠30 d，外周血白细胞和淋巴细胞的数量减少、免疫球蛋白和补体的水平降低，并造成胸腺和脾脏组织结构损伤，但于辐射后7 d逐步恢复[10]。尽管关于微波复合暴露生物效应影响的研究已有一些报道，但微波生物效应与其功率密度、频率、波形、调制和暴露持续时间有关，不同种类的微波引起的效果可能不同，复合效应也会存在差异。本研究以Wistar大鼠为实验对象，运用行为学和病理学等相关实验技术，探索L和C波段微波复合暴露致大鼠突触结构和认知功能的影响，从而为评估微波复合暴露的安全性提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

二级雄性Wistar大鼠128只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体重180～200 g。随机分为L波段微波暴露组(L组)、C波段微波暴露组(C组)、微波复合暴露组(C+L组)和假辐射组(Sham组)，每组32只。

1.2 微波辐射方法

大鼠固定于照射圆盘内，分别采用L(1.5 GHz)或C波段(4.3 GHz)脉冲微波单独照射以及L和C波段脉冲微波复合照射，平均功率密度均为30 mW/cm2，暴露时长均6 min。假辐射组大鼠采取相同处理，但不开启照射源。

1.3 Morris水迷宫

照射前两天利用水迷宫实验筛选大鼠，淘汰不适合游泳的大鼠，最终保证每组15只大鼠进行水迷宫实验。将水迷宫实验箱体划分为一、二、三和四象限，每个象限的中点为大鼠的入水点，池壁周围粘贴颜色与形状不同的4个图案标记，分别为红三角形、绿圆形、白四边形与黄六边形。逃生平台直径约10 cm，高度19 cm，放置在第一象限，具体定位在水池中心与第一象限池壁中点的连线中点处，平台隐匿于水下1.5 cm处。实验过程中水温保持在23±2℃，水池以遮光布围住，图像采集摄像头位于水池正上方，防止周围环境的变动和实验人员走动对于实验动物的影响。实验大鼠在照后0～4 d，进行水迷宫定位航行实验，每只实验大鼠分别从水迷宫池壁选定的四个象限入水点处入水，在每个象限的探索时长为60 s，软件记录大鼠在60 s内找到平台的时间，即平均逃避潜伏期，找到平台后，保持大鼠在平台上停留15 s，若大鼠在入水后60 s内未能成功找到水下平台，则人为引导其至平台，学习15 s。照射后6 d进行水迷宫空间探索实验。将水下的隐匿平台撤除，其余条件保持不变，将实验大鼠从实验箱体的第三象限(即原平台所在象限的对侧象限)放入水中，以软件记录下大鼠在30 s时间内穿越原平台象限的次数与原平台象限的时间比。

1.4 旷场和高架十字迷宫实验

旷场实验设备由100 cm×100 cm×40 cm(长×宽×高)不透明黑色开放箱体构成，实验过程中以遮光布围住四周。在电脑上将旷场底部划分为9个正方形小格，中心方格为中心区，周围8个小方格为周围区。每只实验动物的测试时间为5 min。实验大鼠于照后6 h开始旷场实验。捏住大鼠尾巴根部2/3处将大鼠放置在中心区，记录5 min内大鼠的中心区路程、周围区路程、抬头次数(后肢垂直站立计入抬头次数)、粪便颗粒数。每只实验动物完成该行为学检测后，以75%酒精擦拭实验敞箱，防止该只大鼠气味残留，造成对后续实验动物的影响。

高架十字迷宫由距离地面70 cm的中央平台、两个开放臂和两个闭合臂组成。高架地板面用不透明布遮盖，防止因反光增加实验动物恐惧感。实验员距离高架设备1米以上，防止干扰实验结果。照后3 d进行高架十字迷宫实验。将实验大鼠从中央区面朝开放臂放入设备，记录5 min内大鼠在闭合臂与开放臂的时间。每只实验动物完成该行为学检测后，用75%酒精擦拭实验箱架，防止大鼠残留气味，影响后续实验动物。

1.5 Golgi染色

辐射后6 h、7 d、14 d和1个月，每组随机选取8只大鼠进行实验。采用1%戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠后断头，冰上操作剥离脑组织。①浸液：立即将取出的脑组织浸入1∶1混合的Golgi染色A、B试剂中，脑组织在AB混合液中固定2～3周后取出，换至C液再次固定，时间不超过1周，全程避光操作。②冰冻切片：提前将冰冻切片机预冷>2 h，将脑组织从C液取出后进行快速冰冻，随后以冰冻包埋剂(Tissue Freezing Medium，OCT)将脑组织固定在样品托(无需OCT包埋脑组织)进行冰冻，切片温度-23℃，根据脑组织的情况适当调整，切片厚度100 μm。脑片固定在载玻片后立即滴加C液，防止干片，随后以滤纸吸干周围多余液体，切片盒常温避光保存。③染色：双蒸水润洗切片2次，5 min/次；Solution D∶Solution E∶ddH2O=1∶1∶2(现用现配)使切片重新水化，时长10 min，期间以玻璃棒不断搅拌；双蒸水润洗2次，4 min/次，以胶头滴管滴加防脱片；梯度(50%、75%、95%、100%)酒精脱水，每个梯度脱水4 min；二甲苯透明3次，4 min/次；中性树脂胶封片；晾干后，用光学显微镜观察并拍照，采集不同分组染色图。④图像分析：采用Image J软件分析大鼠海马树突棘数量及蘑菇状树突棘所占比例。

1.6 数据处理及统计学分析

2 结果

2.1 微波辐射对大鼠空间学习记忆能力的影响

在照射前2 d及照射后0～4 d的Morris水迷宫定位航行实验中，与Sham组和C+L组相比，L组大鼠在微波暴露后2 d平均逃避潜伏期显著缩短(P<0.05)，其余各组间无统计学差异(P>0.05)，如图1A所示。照后6 d的Morris水迷宫空间探索实验结果显示，各组间大鼠穿越平台次数均无统计学差异(P>0.05)，如图1B所示。

图1 微波复合暴露后大鼠Morris水迷宫实验结果A：照射前2 d及照射后0～4 d，Morris水迷宫定位航行实验平均逃避潜伏期，其中-1 d表示照射前1 d，-2 d表示照射前2 d，0～4 d表示照射后0～4 d；B：照射后6 d，Morris水迷宫空间探索实验穿越平台次数

2.2 微波辐射对大鼠情绪的影响

2.2.1 旷场实验

微波暴露后6 h旷场实验结果显示，与Sham组相比，C组大鼠在中央区的探索时间和探索路程无显著差异(P>0.05)，L组、C+L组大鼠在中央区的探索时间和探索路程显著延长(P<0.05)；与C组相比，C+L组大鼠在中央区探索时间也显著延长(P<0.05)，如图2A和图2B所示。各组间大鼠探索总路程无显著差异(P>0.05)，如图2C所示。结果提示，平均功率密度为30 mW/cm2的L波段单独暴露与L和C波段复合暴露6 min，可降低大鼠焦虑程度。

图2 微波复合暴露后大鼠旷场实验结果A：中央区探索时间；B：中央区探索路程；C：探索总路程

2.2.2 高架十字迷宫实验

微波暴露后3 d高架十字迷宫实验结果显示，与Sham组相比，C组大鼠在开放臂停留时间显著延长(P<0.05)，L组与C+L组均无统计学差异(P>0.05)，如图3所示。

图3 微波复合暴露后大鼠高架十字迷宫实验结果

2.3 微波辐射对大鼠海马树突棘可塑性的影响

2.3.1 微波暴露后海马锥体细胞树突棘密度与蘑菇状树突比例改变

由图4A和4B可知，与Sham组相比，照射后6 h、7 d、14 d和1个月，C组和C+L组海马锥体细胞树突棘密度均无显著差异(P>0.05)；L组海马锥体细胞树突棘密度仅在照射后14 d显著降低(P<0.01)。由图4C可知，与Sham组相比，C组海马锥体细胞蘑菇状树突棘占比在照射后6 h显著升高(P>0.05)，照射后7 d、14 d和1个月均无显著差异(P>0.05)；L组海马锥体细胞蘑菇状树突棘占比在照射后7 d显著降低(P>0.05)，照射后6 h、14 d和1个月均无显著差异(P>0.05)；C+L组在照射后6 h和7 d海马锥体细胞蘑菇状树突棘占比均无显著差异(P>0.05)，照射后14 d和1个月锥体细胞蘑菇状树突棘占比显著升高(P<0.01或P<0.05)。

图4 微波复合暴露对海马锥体细胞树突棘的影响A：海马锥体细胞树突棘形态；B：树突棘密度；C：蘑菇状树突棘比例

2.3.2 微波暴露后海马颗粒细胞树突棘密度与蘑菇状树突比例改变

由图5A和5B可知，与Sham组相比，C组海马颗粒细胞树突棘密度在照射后6 h和1个月显著升高(P<0.05)，照射后7 d和14 d均无显著差异(P>0.05)；L组海马颗粒细胞树突棘密度仅在照射后7 d极显著降低(P<0.01)，照射后6 h、14 d和1个月均无显著差异(P>0.05)；照射后6 h、7 d、14 d和1个月，C+L组海马颗粒细胞树突棘密度均无显著差异(P>0.05)。由图5C可知，与Sham组相比，C组和L组海马颗粒细胞蘑菇状树突棘占比在照射后14 d显著升高(P<0.01)，照射后6 h、7 d和1个月均无显著差异(P>0.05)；C+L组在照射后6 h海马颗粒细胞蘑菇状树突棘占比显著降低(P<0.05)，照射后14 d颗粒细胞蘑菇状树突棘占比显著升高(P<0.05)，照射后7 d和1个月均无显著差异(P>0.05)。

图5 微波辐射对海马颗粒细胞树突棘的影响A：海马颗粒细胞树突棘形态；B：树突棘密度；C：蘑菇状树突棘比例

3 讨论

研究表明，脑组织是微波辐射最为敏感的靶器官之一，一定剂量的微波对脑的损伤主要表现为认知功能损伤。海马是哺乳类动物学习记忆的关键结构，微波辐射致海马损伤常表现为学习记忆功能障碍，但微波辐射引起突触可塑性损伤、学习记忆能力下降等功能障碍的原因尚未完全阐明，且目前相关研究多集中于某一波段微波的单独暴露。

Morris水迷宫广泛应用于评估空间学习记忆等功能[11-13]。研究表明，一定剂量的微波照射后大鼠平均逃避期显著延长[14-15]，也有研究显示，微波辐射不影响大鼠的平均逃避潜伏期，安广洲等[11]发现亚纳秒瞬态电磁脉冲对SD大鼠水迷宫实验中的平均逃避潜伏期和目标象限百分比没有影响。朱睿卿等研究发现10 mW/cm2的L和C波段微波单一及复合辐射后大鼠AEL延长，大鼠空间学习和记忆水平下降[5]。本研究结果显示，平均功率密度为30 mW/cm2的L波段和C波段微波单独/复合暴露6 min对大鼠空间学习记忆能力无显著影响。

旷场实验用于评价实验动物处于新环境中的自主行为、探究行为以及紧张度，以中央区探索时间百分比评价大鼠焦虑情绪，中央区探索时间越短，焦虑情绪越严重。高架十字迷宫可评价啮齿类动物焦虑样情绪与焦虑样行为，设备由开放臂与闭合臂两部分组成，大鼠在开放臂时，表示好奇天性战胜恐惧心理，即焦虑情绪不严重；在闭合臂时，表示恐惧心理战胜好奇天性，焦虑程度较高[17-18]。Rakesh (2008年)发现2450 MHz长期非热微波暴露后，大鼠在高架十字迷宫中心区的时间显著增加[19]。林丹等发现，功率密度为10 mW/cm2的1～6 GHz多频复合微波辐射照射1周后可导致小鼠发生焦虑样行为，而1 mW/cm2或5 mW/cm2的1～6 GHz多频复合微波照射未引发小鼠焦虑样行为[20]。孙立君等将小鼠分别暴露于高频电磁辐射箱(频率为3 GHz，SAR值为4 W/kg，4 h/d)1 d、3 d和7 d后发现，持续高频电磁辐射可时间依赖地导致小鼠焦虑样-抑郁样行为，当SAR值为8 W/kg时，各项行为学指标出现了非规律性、无法解释的改变[21]。研究表明，长期接受微波暴露的小鼠可能存在焦虑样情绪加重的情况，接受短期微波暴露的动物，焦虑样情绪改变结果差异大，表现为无焦虑样情绪改变、焦虑样情绪增加或降低等。本研究采用旷场和高架十字迷宫实验检测微波照射后大鼠焦虑样情绪变化。旷场实验显示，L组、C+L组大鼠的中央区探索时间和路程显著延长，高架十字迷宫结果显示，C组大鼠在开放臂滞留时间百分比显著上升；提示大鼠在C波段或L波段微波单独/复合暴露后，焦虑情绪出现不同程度的降低，且对新事物的探究增加。与以往研究结果存在一定的差异，主要与使用的暴露系统频率或信号、暴露方式、动物吸收的能量和遗传背景等有关[22]，其机制仍需进一步深入研究。

海马是学习记忆的关键部位，不同区域由不同的神经元构成，其中海马CA1与CA3区主要分布有锥体细胞，海马DG区主要分布有颗粒细胞。树突分枝的棘状凸起成为树突棘，是神经元间形成突触的重要部位。对于哺乳类动物的学习与记忆过程，树突棘的形态与形成脱落等现象均可认为与突触可塑性密切相关[23]。树突棘的典型形态由末端树突棘头部与连接树突的颈部构成。树突棘的发育共可分为以下四个阶段：发育前体/丝状伪足型、细长型、断株型和成熟蘑菇型。其中成熟蘑菇型树突棘异于其他三个类型的突出特征，具有大约0.8 μm长的颈部。

树突棘的形态变化与分布差异对于学习记忆形成与功能性维持具有重要意义，是突触可塑性中结构可塑性的关键。由海马区传入一定刺激所引起的长时程增强过程中存在树突棘密度增加、树突棘头部增大等现象[23]。过度的刺激同样会造成树突棘萎缩等损伤。刺激与突触可塑性相互作用，各种行为会刺激树突棘可塑性，而树突棘结构的变化同样可以反作用于行为发生，从而影响哺乳类动物行为[24-25]。已有研究表明，微波辐射对海马锥体细胞的蘑菇状树突占比影响较大，接受微波辐射后成熟蘑菇状树突棘形态发生了一系列改变，或表现为成熟蘑菇状树突棘萎缩变小为未成熟形态，或成熟蘑菇状树突棘增多。本研究结果可见，C波段微波单独暴露可引起大鼠海马颗粒细胞树突棘密度的增加，颗粒细胞和锥体细胞蘑菇状树突棘比例的增加，表明C波段微波暴露可不同程度促进海马锥体细胞和颗粒细胞树突棘可塑性；L波段单一暴露可引起大鼠海马锥体细胞(14 d)以及颗粒细胞(7 d)树突棘密度的减低，颗粒细胞蘑菇状树突棘比例(14 d)的增加，表明L波段微波暴露对海马锥体细胞和颗粒细胞树突棘可塑性呈一过性抑制作用，颗粒细胞成熟树突棘代偿性增加；C波段和L波段复合暴露仅引起大鼠海马锥体细胞蘑菇状树突棘比例的增加(14 d)，表明复合暴露可一过性促进锥体细胞树突棘可塑性。因此，微波暴露后树突棘密度和成熟树突棘比例的增加，可能促进了大鼠学习记忆能力的维持和恢复，但这与行为学之间的关联性仍需进一步深入研究。

4 结论

综上所述，本研究发现30 mW/cm2的L波段和C波段微波照射大鼠6 min，对大鼠的空间学习记忆能力无影响，可降低焦虑情绪；对大鼠海马树突棘结构的影响存在频率差异性：C波段单独暴露促进大鼠海马树突棘可塑性；L波段单独暴露对海马锥体细胞和颗粒细胞树突棘可塑性呈一过性抑制作用，颗粒细胞成熟树突棘代偿性增加；C和L波段复合暴露一过性促进锥体细胞和颗粒细胞成熟树突棘的增加；这为进一步深入探讨微波复合暴露对脑损伤机制及防护奠定了基础。