黔产缬草RAPD-PCR反应体系的优化与建立

许浩翔艾蓉姜玲玲雷露王清峰周景瑞王鑫刘林洋卜芬余波

(1.贵州省农业科学院畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 550005；2.贵州师范学院，贵州 贵阳 550018)

前言

缬草(Valeriana officinalis L.)属败酱科，多年生高大草本植物，分布于中国东北、西南地区[1]，贵州地区山多，气候温和，山阴多潮湿，拥有缬草生长的良好地理环境。缬草具有安心神，祛风湿，行气血，止痛的功效；叶揉碎外涂镇痛活血，根部可入药，加工成缬草挥发油、缬草提取物等产品，是药品、保健品、烟用香精的重要原料，主要出口欧洲和日本，是美国10大畅销天然产物制剂之一[2，3]。但随着缬草需求的日益增长，人工种植产业形成规模化生产，过度的人工干预导致产量提升的同时出现了品种退化，药材质量下降，产油率降低的现象[4]，这些问题严重制约了缬草产业的发展。随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)技术是建立在聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)技术基础上的遗传标记技术，特点是方法简单不需内切酶，具有耗费少效率高的优点[5]，该技术的指纹图谱在物种分类和品种鉴定，遗传关系分析，遗传多样性评价，资源保护有非常重要的作用[6]。

为促进黔产缬草的开发与利用，本研究选用黔产宽叶缬草和尖叶缬草进行随机扩增多态性分子标记，筛选RAPD反应体系的影响因素，建立适用于黔产缬草RAPD-PCR分析的反应条件，提高试验的稳定性和重复性，为黔产缬草优质资源的鉴别和保护提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

宽叶缬草和尖叶缬草随机采集于贵州江口县、剑河县、岑巩县3个地区，采集后放于硬质透明塑料袋冷藏保存，移置实验室放于冰箱4℃保存，缬草采集地点、采集品种及样品编号详见表1。

1.2 实验试剂和仪器

DNAsecure新型植物DNA提取试剂盒，2×TaqMaster Mix，GoldView I型核酸染色剂，购于天根生化科技有限公司；DL 2000 Marker和Premix Taq(Ex Taq Version2.0 pius dye)，购于大连宝生生物工程股份有限公司；50*TAE Buffer，购于上海生工生物工程股份有限公司。

梯度PCR扩增仪(BIOMETRA)，德国耶拿分析仪器股份公司；凝胶成像仪(BIO-RAD Gel Doc XR)，美国伯乐公司；电泳仪(DDY-10C)，北京六一生物科技有限公司；通台式冷冻离心机(5804R-effdorf)，德国艾本德股份公司。

1.3 实验方法

1.3.1 黔产缬草幼叶样品采摘

采摘宽叶缬草和尖叶缬草的幼叶并进行编号。

1.3.2 试剂盒法提取基因组DNA

根据天根生化科技有限公司的新型植物DNA提取试剂盒说明书进行缬草DNA的提取。

1.3.3 引物筛选

利用Primer 5.0基因分析软件设计8对引物，实验采用多个DNA模板筛选引物，以50μL为PCR反应体系总量进行试验，每对引物分别对样品进行PCR扩增，利用0.2%琼脂糖电泳80min，电压110V，凝胶成像系统查看DNA指纹图谱，筛选扩增结果稳定、条带清晰度高、多态性丰富的引物。引物编号、引物序列和产物大小详见表2。

表2 引物序列

1.3.4 退火时间筛选

以50μL的PCR反应体系进行试验，PCR仪程序设置不同的退火时间为30s、60s、90s，分别进行扩增，检测扩增产物多态性，扩增产物电泳方法同1.3.3。

1.3.5 退火温度筛选

以50μL的PCR反应体系进行试验，PCR仪程序置不同的退火温度为45℃、50℃、55℃，分别进行扩增，检测扩增产物多态性，扩增产物电泳方法同1.3.3。

1.3.6 PCR反应酶筛选

将已筛选出的引物、退火时间、退火温度应用到PCR反应酶的筛选试验中，以50μL的PCR反应体系试验，选择天根生化科技有限公司的2×Taq Master Mix和大连宝生生物科技有限公司的Premix Taq(Ex Taq Version2.0 pius dye)分别进行PCR扩增，检测扩增产物多态性，扩增产物电泳方法同1.3.3。

2 结果和分析

2.1 引物电泳结果分析

分别用引物Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8对14个样品进行PCR扩增，结果表明，引物Y4能将所有样品扩增出目的条带，且清晰度高，表明引物Y4能够作为黔产缬草RAPD-PCR引物的扩增。其余7种引物扩增的目的条带只有部分显示，且不清晰，表明引物Y1、Y2、Y3、Y5、Y6、Y7、Y8不能够作为黔产缬草RAPD-PCR引物的扩增，结果见图1。

图1 8种不同引物的电泳结果

2.2 不同退火时间筛选结果分析

对黔产缬草RAPD-PCR反应体系退火时间进行单因素实验，将退火时间设置为30s、60s、90s。结果表明，当退火时间为60s时，样品均有扩增的目的条带显示，丰富度好且清晰度高；当退火时间为30s和90s时，样品条带不能够全部显示，且存在不清晰条带。综合试验，选择不同退火时间(30s、60s、90s)对样品K1、K2、K3、J1、J2、J3进行同板电泳检测。结果显示，不同退火时间对样品扩增结果的影响程度大小依次为60s>30s>90s，表明60s的退火时间适合黔产缬草RAPD-PCR反应体系，结果见图2。

注：M为Marker DL2000；K1～K7和J1～J7为样品目的条带；K11～K13和J11～J13为退火30s的样品；K21～K23和J21～J23为退火60s的样品；K31～K33和J31～J32为退火90s的样品目的条带。

2.3 不同退火温度筛选结果分析

选取45℃、50℃、55℃对黔产缬草RAPD-PCR反应体系进行退火温度单因素实验。结果表明，退火温度为50℃时，样品扩增的目的条带数量多且清晰度高；当退火温度为45℃、55℃时，样品扩增的目的条带清晰度低，数量低。选择不同退火温度(45℃、50℃、55℃)的扩增样品K1、K2、K3、J1、J2、J3进行同板电泳检测。结果显示，退火50℃时样品扩增的目的条带数量最多且清晰度高，总体显示不同退火温度对样品扩增结果的影响程度大小依次为50℃>45℃>55℃，表明50℃的退火温度适合体系，结果见图3。

注：M为Marker DL2000；K1～K7和J1～J7为样品目的条带；K11～K13和J11～J13为退火45℃的样品；K21～K23和J21～J23为退火50℃的样品；K31～K33和J31～J32为退火55℃的样品目的条带。

2.4 不同PCR反应酶筛选结果分析

分别使用天根生化科技有限公司的2×Taq PCR Master Mix和大连宝生生物工程股份有限公司的Premix Taq(Ex Taq Version2.0 pius dye)对黔产缬草进行PCR扩增。结果显示，天根生化科技有限公司的2×Taq PCR Master Mix扩增的目的条带数量多且清晰度高，大连宝生生物工程股份有限公司的Premix Taq(Ex Taq Version2.0 pius dye)，样品扩增的目的条带数量少且清晰度低。表明天根生化科技有限公司的2×Taq PCR Master Mix更加适合黔产缬草RAPD-PCR反应体系。扩增结果见图4。

注：M为Marker DL2000；K1～K7和J1～J7为样品目的条带；K11～K14和J11～J14为天根生化科技有限公司的PCR Master Mix扩增的样品；K21～K24和J21～J24为大连宝生生物工程股份有限公司的PCR Master Mix扩增的样品目的条带。

2.5 PCR最佳反应体系重复性试验

根据单因素优化实验结果，选择引物F-GAAAAGG GAAGAGGACCTGC、R-AGTTCTCCTCCGCTACCTCC，退火温度50℃，退火时间60s，天根生化科技有限公司的2×Taq PCR Master Mix反应酶，作为黔产缬草 RAPD-PCR反应体系的条件，在随后的3周内对缬草样品进行重复多次实验，结果表明，在该实验条件下，重复性高，可靠性强。

3 结论

在现代药理学研究中，缬草具有安神、改善睡眠、抗抑郁的作用[7，8]，早在唐代，《新修本草》中便记录了缬草，《本草纲目》上也记载缬草：“安神，理气，止痛”。在欧洲，缬草甚至被誉为“睡神草”，所以探究RAPD-PCR最佳反应体系能够有效应用于缬草种质资源鉴定和遗传多样性分析，有助于黔产缬草产业的发展。RAPD-PCR方法简单、成本低[9]，其扩增结果的稳定性和准确性对遗传多样性分析研究至关重要。在本研究中发现，退火温度对扩增结果影响很大，这与史辉等[10]对太子参RAPD反应体系的优化实验中得出的结果一致。在Williams等[11]的研究中发现，当退火温度高于40℃时会抑制RAPD-PCR的反应，从而影响扩增结果；在本研究中，随着退火温度的升高，扩增条带结果越不清晰，但是在一定的退火温度范围内，温度越高越有利于扩增，本实验中45℃的扩增结果条带数量少，55℃时条带不清晰，而在50℃时条带数量多且清晰，这可能是因为高温会消除分子内的二级结构，增强引物与模板的复性，从而提高扩增效率，而温度过高时，会使引物和模板之间结合不紧密，容易脱落，减少有效的扩增条带[12]。

退火时间与引物的长度有关，过长的退火时间会降低酶的活性，过短的退火时间会导致引物没有与DNA链完全连接，从而影响扩增结果[13]。在本实验中，30s和90s的退火时间都不能使扩增条带清晰明亮，在60s时能够扩增出所有样品条带，并且清晰可见，合适的退火时间能够让引物能够更好的和酶反应，这在王金斌等[14]和南文卓[15]研究中也得到了体现。

TaqDNA聚合酶具有5′→3′聚合作用和核酸外切酶活性，选择合适的Taq DNA聚合酶对PCR扩增反应至关重要。本研究中对比了2家不同公司的TaqDNA聚合酶，由于TaqDNA聚合酶是Mg2+依耐性酶，对Mg2+浓度十分敏感[16]，所以当聚合酶用量、dNTPS浓度、缓冲液不同时，会对扩增结果造成极大的影响。本研究中发现，天根生化科技有限公司的TaqDNA聚合酶更加适合黔产缬草RAPD-PCR的反应体系。

本研究对黔产缬草建立的RAPD-PCR反应体系和反应程序，为缬草种质资源鉴定、种间关系研究提供依据，也为选育优良的缬草品种创造条件。