贵州天名精全草中乙酸乙酯部位化学成分的分离鉴定*

陈洁, 王丹, 张雄, 彭明友, 晏英,, 汤磊, 王颖,***

(1.贵州医科大学 药学院, 贵州 贵阳 550025; 2.贵州医科大学 贵州省化学合成药物研发利用工程技术研究中心, 贵州 贵阳 550004)

天名精属(Carpesium)为菊科(Compositae)植物,多年生草本,该属在全世界约有21个种,在我国的西南片区有丰富的植物资源,主要品种有天名精C.abrotanoidesLinn.、贵州天名精C.faberiWinkl.、烟管头草C.cernuumL.及金挖耳C.divaricatumSieb. et Zucc.等[1]。Carpesium植物的根、茎、叶子及其果实都在民间长期入药,具有解毒清热、止血祛痰以及杀虫等功效[2]。自1949年有学者开始对Carpesium化学成分进行研究,迄今为止,已从该属植物中分离到至少306个化合物,结构类型包括倍半萜内酯类化合物、黄酮类化合物及芳香族类化合物等[3-4]。经过药理活性评估,发现从Carpesium中所得的某些单体化合物具有抗肿瘤、抗疟原虫、抗炎、抗菌等多种生物活性[5-8],目前对天名精、金挖耳的研究相对较多,也得到了不错的成果[2],但对贵州天名精的研究相对较少,本研究将其作为研究对象,对其化学成分进行鉴定。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1植物来源 贵州天名精样品采自贵州省凯里市,经过贵州中医药大学孙庆文老师鉴定为贵州天名精(Carpesiumfaberi),凭证标本(TMJ 201909)保存于贵州医科大学药学实验室。

1.1.2主要试剂与仪器 色谱级甲醇、乙腈(科密欧试剂公司),核磁用氘代试剂(美国CIL氘代试剂);柱层析所用硅胶为200～300目(烟台江友硅胶开发有限公司),C18反相硅胶(日本YMC公司),色谱柱Waters sunfire C18(美国Waters公司),旋转蒸发仪(东京理化公司),SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(北京市泰和格润仪器有限公司),Bruker HTC/Esquire质谱仪(德国布鲁克公司),高效液相色谱仪为Agilent 1260型(美国安捷伦公司),Xevo G2-XS型四极杆-飞行时间质谱仪(美国Waters公司),HH-2数显恒温水浴锅(贵州澳华仪器有限公司),UP-Ⅱ优谱系列超纯水机(四川优谱超纯科技有限公司),Bruker AV-600 MHz核磁共振仪(德国布鲁克公司)。

1.2 实验方法

1.2.1乙酸乙酯层初步分离 将贵州天名精全草30 kg切碎,乙醇浸泡提取48 h,所得的浸膏于通风橱中挥发干直至无醇味,得浸膏12 kg;使用乙酸乙酯进行萃取3次,萃取液蒸发浓缩、风干,得浸膏1.5 kg;浸膏充分溶解,使用石油醚湿法装柱,敲打柱体,石油醚反复冲洗,待液面自然沉降至与硅胶面基本相平时,上样,使用石油醚-乙酸乙酯(50∶1至0∶1)系统对样品进行梯度洗脱,经薄层色谱法(thin-layer chromatography,TLC)检测,合并相似流分,共得10个组分,记为Fr1～Fr10。

1.2.2样品Fr5的分离 Fr5(67.5 g)经小孔树脂柱层析(甲醇-水50%至100%)得到8个亚流分,记为Fr5-1～Fr5-8;Fr5-2经反相柱(甲醇-水20%至100%),得到16个亚流分,记为Fr5-2A～Fr5-2P;Fr5-2D经凝胶柱(100%甲醇)得到5个亚流分,记为Fr2D-1～Fr2D-5;Fr2D-4经正相硅胶柱(石油醚∶二氯甲烷 20∶1至0∶1),得到Fr2D-4A经过制备型TLC的到化合物2(10 mg);Fr5-2I经正相硅胶柱(石油醚∶乙酸乙酯 20∶1至2∶1),8个亚流分,记为Fr2I-1～Fr2I-8;Fr2I-6经制备型TLC,得到化合物3(7.5 mg)。

1.2.3样品Fr6的分离 Fr6经过MCI柱(甲醇-水30%至100%),得到17个亚流分记为Fr6A～Fr6P,Fr6M经硅胶柱(石油醚∶乙酸乙酯 8∶1至0∶1)得到亚流分Fr6M-2,经过凝胶柱(100%甲醇),得到亚流分Fr6M-2A经过制备型高效液相色谱仪(preparative high performance liquid chromatography,PHPLC,流动相为70%乙腈-水,流速2.0 mL/min,保留时间32 min)得化合物5(10 mg);Fr6O经硅胶柱(石油醚∶乙酸乙酯10∶1至0∶1)得到亚流分Fr6O-4,经PHPLC(流动相为90%甲醇-水,流速2.0 mL/min,保留时间25 min)得到化合物6(8 mg)。

1.2.4样品Fr7的分离 Fr7样品经混合溶剂溶解,二氯甲烷湿法装柱,用二氯甲烷∶甲醇(100∶0至0∶1)系统对样品进行梯度的洗脱,所得的流分经TLC检测后,将相似的流分合并,得到9个亚流分,记为Fr7A～Fr7I,其中Fr7E部分经过小孔树脂柱层析(甲醇-水30%至100%),得到13个亚流分,记为Fr7E-1～Fr7E-13;Fr7E-10经反相(甲醇-水40%至100%),得到16个亚流分,记为FrE10-A～FrE10-P;FrE10-H经凝胶柱(100%甲醇),得到6个亚流分,记为Fr10H-1～Fr10H-6;Fr10H-4经正相硅胶柱(石油醚∶乙酸乙酯5∶1至0∶1),得到10个亚流分,记为FrH4-1～FrH4-10;FrH4-4经PHPLC(流动相为38%甲醇-水,流速2.0 mL/min,保留时间33 min)得到化合物8(7.8 mg);FrH4-8经PHPLC(流动相为38%甲醇-水,流速2.0 mL/min,保留时间33 min)得到化合物9(15.1 mg);FrE11-E经过硅胶柱(石油醚∶乙酸乙酯 20∶1至5∶1)得到亚流分Fr11E-2,经PHPLC(流动相为95%甲醇-水,流速2.0 mL/min,保留时间35 min)得到化合物7(14 mg);Fr7F-6F经凝胶柱(100%甲醇),得到亚流分Fr6F-1、Fr6F-2;Fr6F-1经PHPLC(流动相为52%甲醇-水,流速1.3 mL/min,保留时间25 min)得到化合物1(14.5 mg);Fr6F-2经过硅胶柱(石油醚∶丙酮 30∶1至5∶1)得到亚流分Fr6F-2B,经PHPLC(流动相为48%甲醇-水,流速2 mL/min,保留时间37 min)得到化合物4(9 mg)。

2 结果

2.1 化合物1

无定形粉末;ESI-MS为m/z225 [M+H]+(C13H20O3);1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ为7.02(1H,d,J= 15.6 Hz,H-7),6.28(1H,d,J= 15.6 Hz,H-8),3.89(1H,d,J= 4.2 Hz,H-3),2.38(1H,ddd,J=14.4,4.8,1.2 Hz,H-4α),2.27(3H,s,H-10),1.66(1H,d,J= 9.0 Hz,H-4β),1.64(1H,m,H-2α),1.27(1H,dd,J= 10.2,2.6 Hz,H-2β),1.19(6H,s,H-12,13),0.97(3H,s,H-11);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ为197.4(C-9),142.4(C-7),132.6(C-8),69.5(C-6),67.3(C-5),64.0(C-3),46.6(C-2),40.6(C-4),35.1(C-1),29.3(C-12),28.3(C-10),24.9(C-11),19.8(C-13)。鉴定化合物1为3β-羟基-5α,6α-环氧-7-大柱香波龙烯-9-酮。化学结构式如图1所示。

2.2 化合物2

淡黄色油状物;ESI-MS为m/z269 [M+H]+(C14H20O5);1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ为6.91(1H,d,J=8.0 Hz,H-5),6.71(1H,s,H-2),6.65(1H,dd,J=8.0,1.0 Hz,H-6),4.53(1H,d,J=12.0 Hz,H-9α),4.43(1H,d,J=12.0 Hz,H-9β),3.87(1H,d,J=12.0 Hz,H-10α),3.79(1H,d,J=12.0 Hz,H-10β),2.57(1H,dt,J=14.0, 7.0 Hz,H-2′),2.27(3H,s,H-7),1.13(3H,d,J=4.2 Hz,H-3′),1.12(3H,d,J=4.2 Hz,H-4′);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ为178.5(C-1′),156.8(C-3),140.3(C-1),126.4(C-2),120.8(C-5),119.7(C-4),118.9(C-6),79.2(C-8),67.7(C-9),66.1(C-10),34.2(C-2′),21.2(C-7),19.1(C-3′),19.0(C-4′)。鉴定化合物2为8,10-二羟基-9-异丁酰基百里香酚。化学结构式如图1所示。

2.3 化合物3

无色油状物;ESI-MS为m/z361 [M+Na]+(C18H26O6);1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ为6.89(1H,d,J=8.0 Hz,H-5),6.70(1H,s,H-2),6.64(1H,dd,J=8.0,1.1 Hz,H-6),4.45(4H,q,J=12.0 Hz,H-9,10),2.56(2H,dt,J=14.0,7.0 Hz,H-2″,2′),2.27(3H,s,H-7-CH3),1.13(12H,dd,J=6.6,0.6 Hz,H-3′,4′,3″,4″);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ为177.7(C-1′,C-1″),156.9(C-5),140.3(C-1),126.7(C-3),120.7(C-6),119.0(C-2),118.8(C-4),79.0(C-8),67.5(C-9,10),34.1(C-2′,2″),21.2(C-7),19.0(C-3′,4′,3″,4″)。鉴定化合物3为8-羟基-9,10-二异丁酰氧基麝香草酚。化学结构式如图1所示。

2.4 化合物4

无定形粉末;ESI-MS为m/z197 [M+H]+(C11H16O3);1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ为5.69(1H,s,H-6),4.32(1H,d,J=2.4 Hz,H-2),2.46(1H,dt,J=13.8,2.4 Hz,H-3β),1.98(1H,dt,J=14.4,2.4 Hz,H-1β),1.79(1H,s,H-3α),1.76(3H,m,H-11),1.52(1H,dd,J=14.6,3.8 Hz,H-1α),1.46(3H,s,H-9),1.27(3H,s,H-10);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ为182.5(C-5),172.0(C-7),112.9(C-6),86.7(C-4),66.8(C-2),47.3(C-1),45.6(C-3),35.9(C-8),30.6(C-10),27.0(C-11),26.5(C-9)。鉴定化合物4为毛脉五味子醇。化学结构式如图1所示。

2.5 化合物5

无色油状;ESI-MS为m/z309 [M+H]+(C19H32O3);1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ为6.51(1H,dd,J=15.0,10.8 Hz,H-14),5.97(1H,t,J=10.8 Hz,H-15),5.69(1H,dd,J=15.2,6.4 Hz,H-13),5.57(1H,m,H-9),5.43(1H,dt,J=10.8,7.6 Hz,H-16),5.36(1H,m,H-10),4.21(1H,d,J=3.6 Hz,H-12),3.66(3H,s,O-CH3),2.35(2H,m,H-11),2.29(2H,d,J=7.6 Hz,H-2),2.17(2H,q,J=7.8 Hz,H-17),2.07(2H,m,H-8),0.97(3H,t,J=7.8 Hz,H-18);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ为174.6(C-1),135.5(C-9),135.2(C-14),133.1(C-13),128.0(C-115),126.1(C-16),124.0(C-10),72.3(C-10),51.7(-OCH3),35.5(C-11),34.3(C-2),29.7(C-4),29.3(C-5,6),29.2(C-7),27.9(C-8),25.1(C-3),21.0(C-17),14.4(C-18)。鉴定化合物5为(9Z,12S,13E,15Z)-12-Hydroxyoctadeca-9,13,15-trienoic-acid-methyl-ester。化学结构式如图1所示。

2.6 化合物6

淡黄色油状;ESI-MS为m/z297 [M+H]+(C20H40O);1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ为5.40(1H,m,H-2),4.14(2H,m,H-1),1.98(2H,m,H-4),1.67(3H,s,H-20),1.52(1H,m,H-15),1.25(2H,dd,J=6.8, 3.4 Hz,H-7,11),0.86(6H,d,J=6.8 Hz,H-16,17),0.85(3H,d,J=4.4 Hz,H-18),0.84(3H,d,J=4.4 Hz,H-19);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ为140.6(C-3),123.3(C-2),59.7(C-1),40.1(C-4),39.6(C-14),37.7(C-10),37.6(C-8),37.5(C-12),36.9(C-6),33.0(C-11),32.9(C-7),28.2(C-15),25.4(C-5),25.0(C-13),24.7(C-9),22.9(C-17),22.8(C-16),20.0(C-19),19.9(C-18),16.4(C-20)。鉴定化合物6为植醇。化学结构式如图1所示。

2.7 化合物7

淡黄色油状物;ESI-MS为m/z237 [M+Na]+(C15H26O2);1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ为4.74(1H,s,H-12a),4.73(1H,s,H-12b),3.65(2H,s,H-5),2.40(1H,m,H-1),2.35(2H,m,H-7),2.11(3H,s,CH3-15),2.05(2H,m,H-3),1.86(1H,dd,J=16.6,8.4 Hz,H-9),1.80(1H,m,H-10α),1.70(2H,dd,J=14.4,6.6 Hz,H-4),1.64(2H,dd,J=6.6,2.4 Hz,H-8),1.44(1H,s,H-10β),1.04(3H,s,CH3-14),1.03(3H,s,CH3-13);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ为209.3(C-6),152.5(C-2),107.4(C-12),63.0(C-5),48.2(C-9),42.3(C-7),41.6(C-1),40.0(C-10),33.8(C-11),31.3(CH3-14),31.1(C-4),31.1(C-3),30.1(C- CH3-15),24.9(C-8),22.6(C-13)。鉴定化合物7为5-hydroxy-5,6-secocaryophyllen-6-on。化学结构式如图1所示。

2.8 化合物8

无色结晶;ESI-MS为m/z411 [M+Na]+(C21H24O7);1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ为6.90(1H,s,H-2),6.89(1H,d,J=5.0 Hz,H-5),6.82(1H,dd,J=8.2,1.6 Hz,H-6),6.58(2H,s,H-2′,6′),5.61(1H,s,H-7′),5.50(1H,s,H-7),4.73(2H,dd,J=17.4,4.6 Hz,H-9β,9β′),4.26(2H,ddd,J=15.6,9.2,6.6 Hz,H-9α,9α′),3.90(9H,m,H-3,3′,5′-OCH3),3.10(2H,m,H-8,8′);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ为147.1(C-5′,3′),146.7(C-3),145.2(C-4),134.3(C-4′),132.9(C-1),132.1(C-1′),118.9(C-6),114.3(C-5),108.6(C-2),102.7(C-2′,6′),86.1(C-7′),85.8(C-7),71.9(C-9′),71.6(C-9),56.4(C-3′OCH3,C-5′OCH3),56.0(C-3OCH3),54.4(C-8′),54.1(C-8)。鉴定化合物8为5′-甲氧基松脂素。化学结构式如图1所示。

2.9 化合物9

白色粉末;ESI-MS为m/z441 [M+Na]+(C22H26O8);1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ为6.58(4H,s,H-2,2′,6,6′),5.50(2H,s,H-4,4′-OH),4.73(2H,d,J=4.2 Hz,H-7,7′),4.28(2H,dd,J=9.2,6.8 Hz,H-9β,9′β),3.91(2H,d,J=3.6 Hz,H-H-9α,9′α),3.90(12H,s,H-3,3′,5,5′,-OCH3),3.09(2H,dd,J=6.4,4.8 Hz,H-8,8′);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ为147.2(C-3,3′,5,5′),134.3(C-4,4′),132.1(C-1,1′),102.7(C-2,2′,6,6′),86.1(C-7,7′),71.8(C-8,8′),56.4(C-9,9′),54.3(C-3,3′-OCH3)。鉴定化合物9为丁香树脂素。化学结构式如图1所示。

3 讨论

菊科是双子叶植物中最进化的植物类群,不仅属种数最多,而且分布最广,拥有特殊的生物学特性,可谓植物界中的世界冠军;我国境内菊科植物约有240个属、2 300个种;菊科植物性寒,味干苦,据记载其主要功效有清热散风、解毒及明目,适用于感冒发热、心烦苦闷等症状[9-11]。在菊科植物资源中,涵盖很多重要的药用植物、蔬菜作物、油料作物及观赏植物,它们富含多样的生物活性物质[12-13]。所以,菊科植物为活性化合物的发现提供了重要线索,具有潜在的研究价值。

天名精属植物是一种广泛应用的传统药材,长期被东南亚国家用于治疗各种疾病[14]。贵州天名精作为本属植物中药用历史悠久、应用广泛的中草药,具有清热解毒、破瘀止血等功效,富含复杂多样的天然活性产物,但其活性成分和作用机理尚不完全明确[6,15]。为了进一步充分利用药用资源,发掘天名精属植物的潜在价值,本课题组对贵州天名精开展了系统的化学成分研究,进而挖掘潜在活性有效成分,探究了其多样化的生物功能[16-17]。

利用硅胶、MCI gel CHP 20P、葡聚糖凝胶LH-20、Rp-C18、制备薄层色谱、制备型以及半制备型HPLC等多种现代色谱分离手段从贵州天名精全草的乙酸乙酯层中分离9个化合物,使用波谱鉴定技术得到化合物波谱数据,结合波谱数据以及文献报道对比,结合质谱仪确定化合物1～9的结构,分别为3β-羟基-5α,6α-环氧-7-大柱香波龙烯-9-酮(1)[18]、8,10-二羟基-9-异丁酰基百里香酚(2)[19]、8-羟基-9,10-二异丁酰氧基麝香草酚(3)[20]、毛脉五味子醇(4)[21]、(9Z,12S,13E,15Z)-12-Hydroxyoctadeca-9,13,15-trienoic-acid-methylester(5)[22]、植醇(6)[23]、5-hydroxy-5,6-secocaryophyllen-6-on(7)[24]、5′-甲氧基松脂素(8)[25]、丁香树脂素(9)[26]。其中化合物1、4、5、7及9为首次从天名精属植物中分离得到,化合物1为无内酯环倍半萜内酯类化合物,化合物2～4为单萜类化合物,化合物5～7为二萜类化合物,化合物8、化合物9为木脂素类化合物。

在分离过程中使用多种薄层色谱条件对样品进行分析,对于极性大的Fr7部分的样品,本研究找到的最佳薄层色谱条件为二氯甲烷:甲醇为25∶1,5%的硫酸乙醇为显色剂,极性相对小的Fr5、Fr6部分的样品,本研究找到的最佳薄层色谱条件为石油醚:乙酸乙酯为3∶1,5%的硫酸乙醇做为显色剂。采种贵州天名精干燥全草30 kg,经95%乙醇提取、乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯层浸膏1.5 kg,样品量较大,故本研究首先采用粗硅胶(100～200目)对样品次进行划段。因选择贵州天名精的全草,色素含量较多,故本研究对硅胶柱下来的馏分再一次使用小孔树脂进行分离,除去部分色素,以便进行薄层色谱分析时可更清楚地看见化合物的情况。根据薄层色谱情况,选择葡聚糖凝胶LH-20、Rp-C18、正相硅胶柱、制备型HPLC等色谱柱条件对样品进行更加细致分离,得到单体化合物。

综上所述,本研究以民间传统药用植物作为切入点,探究植物贵州天名精中所含化学成分,不仅丰富了药用植物贵州天名精中天然活性产物的多样性,而且为后期其多种作用机制的研究奠定了基础。