狐臭柴叶水提取液延缓秀丽隐杆线虫衰老作用的研究

潘旭芳,周大寨,朱玉昌*

(1.硒食品营养与健康智能技术湖北省工程研究中心,湖北 恩施 445000;2.湖北民族大学 生物与食品工程学院,湖北 恩施 445000;3.生物资源保护与利用湖北省重点实验室,湖北 恩施 445000)

衰老是一种自发的生物过程,在机体的生命中是不可避免的。衰老的过程往往伴随着身体机能的下降,即身体的生理完整性下降,导致身体器官功能性损伤或死亡等风险增加[1]。一些疾病因素也能引发这种身体机能的渐进性丧失[2],如心血管疾病、糖尿病、神经性退行性疾病、帕金森病等。尽管这种衰老的生物过程是不可逆的,但可通过摄入一些活性物质来延缓衰老。大量研究表明水提取物、醇提取物等活性物质具有延缓秀丽隐杆线虫寿命的作用[3-5]。寻找延长寿命的化合物或药物成为了当代科研人员研究的热点。

秀丽隐杆线虫作为模式生物模型,以大肠埃希氏菌为食物,按生长时期分为3个时期,胚胎期(L1)、幼虫期(L2、L3、L4)和成虫期,其已被广泛用于抗衰老相关疾病的研究[6-7]。秀丽隐杆线虫具有生命周期短(易于在实验室大量培养)、身体透明(便于实验观察)、繁殖能力强、全基因组和遗传背景清晰、对外界环境敏感等优点,使其更适合延缓衰老方面的研究。吕晨豪等[8]研究发现陈皮水提取物可以延长秀丽隐杆线虫寿命。杨帆等[9]发现益智仁提取物可以通过提高抗氧化酶活力和抗氧化基因的表达水平,延缓线虫衰老。王轶菲等[10]发现山楂提取物可以有效延缓秀丽隐杆线虫衰老。目前秀丽隐杆线虫作为模式生物在水提取物[4]、醇提取物[11]、多糖[12]、毒性物质评估[13]等方面均有研究。

狐臭柴(PremnapuberulaPamp.),别名长柄臭黄荆、豆腐柴、臭黄荆、臭树、斑鸠占等,属马鞭草科豆腐柴属植物[14-15],在我国广泛分布于华东、中南、华南及西南等地,是一种药食兼用的植物。湖北、湖南等地常用其叶制作凉粉食用,名曰“神仙豆腐”。其功能性成分主要包括黄酮类、多酚类及多糖类等[16],具有降暑消炎、抗氧化、降血糖等[17]药理活性。其叶的水提液中主要含有多糖、黄酮、多酚及氨基酸类物质,具有显著的抗炎、抑菌以及抗氧化效果。Li等[18]发现豆腐柴果胶具有抗氧化和抗炎作用。Song等[19]发现豆腐柴多糖可以通过增强宿主的肠道抵抗力来改善炎症。李爽等[20]发现狐臭柴挥发油具有较强的抗氧化、抗菌和抗肿瘤活性。而狐臭柴叶片功能性成分的研究主要集中在果胶、蛋白质、多酚及黄酮类化合物的提取与抗氧化活性研究,对狐臭柴叶水提取液(PremnapuberulaPamp.leaves water extract,PPW)抗衰老活性方面的研究鲜有报道。

以模式生物秀丽隐杆线虫作为研究对象,测定狐臭柴叶水提取液对线虫寿命、虫体长度、运动能力、紫外应激能力以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的影响,进而以苯酚-硫酸法、酒石酸铁法、硝酸钠-硝酸铝法及考马斯亮蓝法分别测定PPW中多糖、总黄酮、总酚、蛋白质的含量,对延缓线虫衰老机制做了初步研究。以期探究PPW延缓秀丽隐杆线虫衰老的作用,为狐臭柴资源的综合开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

狐臭柴鲜叶于2022年8月采摘于湖北省利川市湖北雄展农业开发有限公司种植基地,经湖北民族大学易咏梅教授鉴定为狐臭柴(PremnapuberulaPamp.)的叶片。鲜叶洗净后于55℃烘干,超微粉碎过60目筛,密封后于4℃保存备用。

N2野生型秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)、大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)OP50由湖北民族大学方庆老师惠助;其他试剂有5-氟尿嘧啶(上海麦克林生化科技有限公司,分析纯),胆固醇(上海源叶生物有限公司,分析纯),琼脂粉、LB肉汤、胰蛋白胨(北京奥博星生物技术有限责任公司,生物试剂)等。

实验仪器有生化培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司,SPX-1505H-II)、高速冷冻离心机(湘仪离心机有限公司,H2050R)、超净工作台(苏洁净化设备有限公司,SJ-CJ-2FDQ)、超微粉碎机(广州市旭朗机械设备有限公司,XL-30C)、超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司,KQ5200E)。

1.2 PPW对秀丽隐杆线虫抗衰老活性的测定

1.2.1 线虫培养及同期化 线虫的培养在线虫生长固体培养基(nematode growth medium,NGM)上进行,称量1.0g胰蛋白胨、6.8g琼脂粉、1.2g NaCl,溶于400mL去离子水中,高温高压灭菌20min,冷却至60℃左右,于超净工作台中加入无菌的400μL1mol/L CaCl2、400μL1mol/L MgSO4、400μL 5mg/mL胆固醇和10mL 1mol/L磷酸钾缓冲液,混匀后倒入培养皿中,每个平板加入100μLE.coliOP50菌液作为线虫食物,置于20℃生化培养箱中培养。

线虫同期化参照文献[21]略有改动,采用裂解法,裂解液为2.5mL无菌水、1.5mL次氯酸钠和1mL 2mol/L NaOH的混合液。用M9缓冲溶液将大量虫卵及成虫期线虫冲洗至14mL无菌离心管中,以6000r/min转速离心3min,用M9缓冲溶液冲洗2次,最后留1mL虫液,加入裂解液后,反复振荡 10min,中间停留30s左右,待看到没有明显虫体时,离心去除上清液,用M9清洗2次,无菌水清洗1次,最后留1mL虫液,将其转到涂有E.coliOP50的NGM培养基上,连续培养72h,即得到同期化的L4期线虫。

1.2.2 PPW制备及给药途径 按狐臭柴粉末与去离子水比例为1∶60(g/mL)在45℃恒温的磁力搅拌器中水浴提取1h,提取结束后以8000r/min转速离心10min,得到上清液备用。以上清液为母液,命名为PPW,用E.coliOP50菌液将其稀释为25%、50%、75%的狐臭柴叶水提取液备用。

给药途径:在24孔板的NGM培养基中加入20μL样品和20μL 5-氟尿嘧啶;在直径为6cm的培养皿中加入1mL样品和1mL 5-氟尿嘧啶。空白组以E.coliOP50菌液为对照,开盖紫外灭菌2h,待其自然晾干。

1.2.3 线虫寿命测定 参照文献[7]略有改动,将L4期的秀丽隐杆线虫转移至空白组和含PPW分别为25%、50%、75%的24孔板,从转移当天开始记为0d,每24h转移线虫至对应的实验组新平皿中,每孔线虫约30条,共90条线虫,每天记录死亡数和存活数,直到线虫全部死亡。判断死亡的标准为:无运动及无食物吞咽行为且用挑虫器拍打虫体无反应。运用SPSS软件绘制生存曲线,计算最长寿命(最后10%存活线虫的平均值)、平均寿命。

1.2.4 线虫虫体长度的测定 培养方法同1.2.3节中的线虫培养步骤,培养4d后收集秀丽隐杆线虫,用NaN3麻醉之后在显微镜下拍照。实验至少重复3次,每组至少30条。

1.2.5 运动能力的测定 培养方法与1.2.3节中的方法相同,培养4d后收集秀丽隐杆线虫,转入加有M9缓冲溶液而不含E.coliOP50菌液的48孔NGM培养基中,每孔1条,每组10条,让其自由运动1min,观察线虫20s内身体弯曲的次数,弯曲标准为秀丽隐杆线虫往虫体长轴方向1个波动记为1次身体弯曲。

1.2.6 线虫抗紫外应激能力的测定 参照文献[22]略有改动,培养方法同1.2.3节中的方法,培养4d后转入到空白的NGM培养基,放在超净工作台(紫外灯的直径为19mm、功率为18W,培养基距紫外灯的距离为135cm)。开盖紫外灭菌,每30min观察并计数各组线虫的生存情况,至所有线虫全部死亡,线虫死亡评判标准与寿命实验标准相同。每孔10条,每组至少30条,每次重复3次平行实验。

1.2.7 线虫体内MDA含量的测定 MDA为脂膜过氧化程度的指标。在高温条件下,可以与硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)反应生成红棕色的三甲川,在532nm处有最大吸光度,运用该原理可测得MDA的含量。将L4期的秀丽隐杆线虫转移至空白组和PPW含量为25%、50%、75%的直径为6 cm的培养皿,每板至少1000条线虫,培养4d之后收集线虫,无菌水清洗2次,去掉上清液。加入提取液,用超声波清洗器破碎虫体,以8000r/min转速离心10min,得到上清液待测。根据双组分分光光度计法,计算MDA的含量,计算公式为

C=[6.45×(A1-A2)-0.56×A3]/Cpr。

其中,C为MDA的含量,单位为μmol/mg;A1、A2、A3分别代表532、450、600nm处的吸光度值;Cpr为线虫体内蛋白质的质量浓度,单位为mg/mL。

1.3 PPW中主要成分测定

1.3.1 多糖的测定 采用苯酚-硫酸法测定PPW中多糖的含量,以葡萄糖醛酸作为标准品,绘制质量浓度为0.2～1.8mg/mL的标准曲线。反应体系中加入2mL标准品、1mL 9%苯酚、5mL硫酸,暗反应30min,在490nm处测吸光度值。得到标准曲线为y=0.0046x+0.0223,R2=0.9941。按标准曲线制作方式加入狐臭柴叶水提取液,根据标准曲线计算PPW中多糖的含量。

1.3.2 总酚的测定 采用酒石酸铁法,绘制没食子酸质量浓度为200～800μg/mL的标准曲线,得到标准曲线为y=0.001x+0.0373,R2=0.9917。按标准曲线制备的方法加入狐臭柴叶水提取液,根据标准曲线计算PPW中总酚的含量。

1.3.3 总黄酮的测定 采用亚硝酸钠-硝酸铝分光光度法,绘制芦丁标准品质量浓度为50～250μg/mL的标准曲线,得到标准曲线为y=0.0038x+0.0157,R2=0.9959。按标准曲线的制作方法加入狐臭柴叶水提取液,根据标准曲线计算PPW中总酚的含量。

1.3.4 蛋白质的测定 采用考马斯亮蓝法,绘制牛血清蛋白标准品质量浓度为0.02～0.12mg/mL的标准曲线,得到标准曲线为y=7.3357x+0.0363,R2=0.9941。按标准曲线的制作方法加入狐臭柴叶水提取液,根据标准曲线计算水提取液中蛋白质的含量。

1.4 数据处理

运用SPSS 26.0软件对实验结果进行单因素方差分析(analysis of variance,ANOVA),采用邓肯式多重比较对差异显著性进行比较分析,P<0.05表示差异显著。运用Origin 2022进行作图分析。

2 结果与分析

2.1 PPW对线虫自然寿命的影响

寿命是评价机体是否衰老的最直接体现。PPW对线虫寿命影响的生存曲线如图1所示。由图1可知,与空白组相比,用不同含量的PPW喂养线虫均可使线虫的生存曲线右移,延长最长寿命。PPW对线虫寿命影响的统计分析如表1所示。由表1可知,使用25%、75%的PPW喂养线虫之后,线虫的平均寿命在13.08d左右,最长寿命上升至19.00d以上,与空白组相比,其平均寿命有显著性差异。当喂养PPW含量为50%时,其最长寿命为20.33d,平均寿命为13.47d,与空白组相比平均寿命延长了16.42%。由此可见,狐臭柴叶水提取液可以显著延缓线虫的自然寿命。该结果与孙翌等[23]研究豆腐柴提取物在适当浓度下可以延长果蝇寿命相似。

表1 PPW对线虫寿命影响的统计分析Tab.1 Statistical analysis of effects of PPW on longevity of Caenorhabditis elegans

图1 PPW对线虫寿命影响的生存曲线Fig.1 Survival plot of the effect of PPW on the lifespan of Caenorhabditis elegans

2.2 PPW对线虫虫体长度的影响

机体的生长状态可以体现喂养浓度对线虫生长的影响,PPW对线虫的体长影响如图2(a)所示。由图2(a)可知,不同含量的PPW对线虫的虫体长度有增长作用。与对照组相比,当喂养PPW含量为25%时,虫体长度得到了显著性上升(P<0.05);当喂养PPW含量为50%、75%时,虫体长度不再增加,表明PPW对线虫的虫体长度没有浓度依赖性。由此得出,PPW可以促进其生长发育,对线虫的生长发育没有毒害作用。

注:不同的字母代表差异显著,P<0.05。注:不同的字母代表差异显著,P<0.05。(a) PPW对线虫虫体长度的影响 (b) PPW对线虫身体弯曲频率的影响图2 PPW对线虫的虫体长度及身体弯曲频率影响Fig.2 Effects of PPW on body length and bending frequency of Caenorhabditis elegans

2.3 PPW对线虫运动能力的影响

运动给机体带来健康的同时也可以延长寿命,陈媛丽[24]发现运动可以通过激活线虫的自噬行为从而延长秀丽隐杆线虫的寿命。以线虫身体的弯曲频率表示线虫的运动能力,其频率越大表明运动能力越强。PPW对线虫身体弯曲频率影响如图2(b)所示。由图2(b)可知,不同含量的狐臭柴叶水提取液对线虫的身体弯曲频率有提高作用。当PPW含量为25%时,与空白组相比,线虫运动能力有差异但差异没有显著性;当PPW含量为50%时,运动能力得到显著性提升,从空白组的1.01次/s上升到1.18次/s,继续增加喂养含量,运动能力不再增加。综上可知,PPW可以显著提高线虫的身体弯曲频率,增强运动能力。

2.4 PPW对线虫抗紫外应激的影响

紫外应激能力可以反映机体对紫外逆环境的适应能力。PPW对线虫紫外损伤的生存曲线如图3所示。由图3可知,对喂养之后的线虫进行紫外损伤测定,与空白组相比,其受紫外损伤的生存曲线向右移,说明PPW饲喂可以显著提高线虫对抗紫外损伤的能力。PPW对线虫紫外损伤影响的统计如表2所示。由表2可知,PPW喂养线虫可使其平均寿命、最长寿命显著性增加(P<0.05),寿命最长达到5.31±0.45h,相对空白组,25%、50%和75%的PPW喂养的线虫平均寿命分别延长21.12%、16.81%和32.96%。综上可知,PPW可以提高秀丽隐杆线虫的抗紫外损伤能力。

表2 PPW对线虫紫外损伤影响的统计分析Tab.2 Statistical analysis of effects of PPW against UV damage of Caenorhabditis elegans

图3 PPW对线虫紫外损伤的生存曲线Fig.3 Survival curves of PPW against UV of Caenorhabditis elegans

2.5 PPW对线虫体内MDA的影响

MDA是衡量氧化损伤程度的指标,反映过氧化程度,其为自由基与脂质发生过氧化而产生的物质,具有细胞毒性,影响线粒体呼吸链复合物及线粒体体内关键酶的活性,从而影响机体寿命[25]。PPW对线虫体内MDA含量的影响如图4所示。由图4可知,PPW可以显著降低MDA的含量(P<0.05)。当PPW的含量为25%时,与空白组相比MDA降低最为明显,随着PPW含量的增加,MDA含量上升达到平衡,说明PPW降低线虫体内的MDA且没有浓度依赖性。综上可知,PPW可以降低MDA对线虫细胞的毒害作用、减少细胞损伤、延缓衰老。这可能与水提取液中多糖含量较高相关。黄少杰等[26]研究发现铁皮石斛叶多糖可通过减缓细胞氧化损伤,进而发挥其延长寿命的功效。

注:不同的字母代表差异显著,P<0.05。图4 PPW对线虫体内MDA含量的影响Fig.4 Effect of PPW on MDA content in Caenorhabditis elegans

2.6 PPW中主要成分分析

PPW中多糖、总酚、总黄酮、蛋白质分别为54.30±3.39、15.52±0.53、13.52±0.90、13.87±0.30mg/g,亦即PPW中含量最多的为多糖类物质,其次为总酚、蛋白质及总黄酮。

3 讨论与结论

3.1 讨论

研究发现,天然植物里面的许多天然化学物质具有抗氧化、抗炎、抑菌等药理活性,并且可以调节氧化应激、延缓衰老。黄少杰等[26]研究发现铁皮石斛叶多糖能够提高秀丽隐杆线虫抗应激能力和减缓细胞氧化损伤,进而发挥其延长寿命的功效。王猛等[27]研究发现褐藻多糖可通过延长秀丽隐杆线虫的寿命,提高其运动能力,提升线虫抗氧化酶活性,调控关键基因的表达。熊磊[28]发现枸杞多酚提取物能增强秀丽隐杆线虫在紫外条件下的应激能力,从而延缓秀丽隐杆线虫的衰老。陈宇[22]研究发现银杏叶黄酮提取物可以通过改善线虫运动状况、抗氧化能力等,从而发挥延缓衰老的作用。综上所述,PPW延缓秀丽隐杆线虫衰老,可能是狐臭柴叶水提取液中多糖、多酚、黄酮等活性物质相互作用的结果。

3.2 结论

为了研究狐臭柴叶水提取液对秀丽隐杆线虫的抗衰老活性,以模式生物秀丽隐杆线虫作为研究对象,测定狐臭柴叶水提取液对秀丽隐杆线虫自然寿命、虫体长度、运动能力、紫外应激能力及丙二醛含量的影响,以苯酚-硫酸法、酒石酸铁法、硝酸钠-硝酸铝法及考马斯亮蓝法分别测定PPW中多糖、总黄酮、总酚、蛋白质的含量,对PPW延缓线虫衰老的机理做了初步研究。结果表明与空白组相比,当PPW含量为25%、50%、75%时,延长了秀丽隐杆线虫平均寿命的13.83%、16.42%、12.27%,在紫外损伤条件下延长了线虫平均寿命的21.12%、16.81%、32.96%。显著增强了线虫的运动能力、延长了虫体长度、显著降低了线虫体内丙二醛的含量。综上所述,狐臭柴叶水提取液可以延缓秀丽隐杆线虫的衰老、降低体内丙二醛含量、促进线虫生长发育、提高运动能力和抗紫外应激能力。该结论可为狐臭柴资源的综合开发利用提供参考。