肿瘤热疗、抗血管治疗与免疫微环境重塑

吴稚冰

随着分子生物学的进展，肿瘤组织与正常组织在血管和免疫微环境上的不同特性逐渐为人所揭示。热刺激可以诱导细胞坏死或凋亡，并且在破坏肿瘤血管的同时激活机体免疫系统，从而调节肿瘤微环境的免疫状态，由此衍生出热疗辅助治疗。热疗是一种利用发热生物热效应和非电离辐射的物理因素来加热组织，从而促进肿瘤细胞凋亡或坏死的物理疗法。肿瘤血管发育不完整、分布较为散乱，阻碍正常CD8+T 细胞进入肿瘤组织。血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）也会抑制树突状细胞（Dendritic cells，DCs）的成熟并诱导CD8+T 细胞耗竭。肿瘤血管生成及免疫环境相互干预的作用使得抗血管治疗联合免疫治疗成为一种有潜力的治疗策略。我们从热疗及抗血管治疗的机制出发，讨论肿瘤热疗、抗血管治疗与免疫治疗联合的治疗模式，为免疫治疗耐受的肿瘤患者探索新的治疗方向。

1 肿瘤细胞重编程

1.1 提高细胞热休克蛋白及损伤相关分子模式信号表达肿瘤热疗通过提高肿瘤细胞热休克蛋白（Heat shock proteins，HSPs）、高迁移率族蛋白 B1（High mobility group box protein1，HMGB1）和程序性细胞死亡因子配体-1（Programmed cell death-Ligand 1，PD-L1）表达来增加肿瘤细胞免疫抗原性，抑制其增殖和迁移。HSPs 由热休克蛋白基因在细胞受热及在其他理化因素（如病毒感染、创伤、缺氧、缺血、重金属离子、紫外线照射等）刺激下启动而选择性合成。HSPs 为一组高度保守性的蛋白质，近年来研究发现其在肿瘤免疫微环境（Tumor microenvironment，TME）中发挥着重要作用。针对小鼠骨肉瘤模型的研究证实热疗对耐药细胞系和原代成瘤细胞系均有杀伤作用且使两种细胞系均表现出HSP70 表达升高[1，2]。研究证明，肿瘤细胞HSP70 及90 的表达上调，促进MHCI 类分子介导的肿瘤抗原肽成熟，进而增强肿瘤细胞免疫原性[3]。

热刺激也会促使细胞表达与分泌一系列损伤相关分子模式信号（Danger associated molecular patterns，DAMPs）。热疗可在诱导肿瘤细胞凋亡的同时，促进其表达与分泌包括HMGB1 在内的DAMPs。HMGB1 通 过HMGB1/TLR4/MyD88 通 路激活肿瘤细胞免疫抗原性，使肿瘤细胞被吞噬细胞有效识别、杀伤、吞噬，进一步诱导CD8+T 细胞活化、增殖，促进抗肿瘤免疫效应[4]。

1.2 促进肿瘤细胞凋亡及死亡细胞生存需要适合的条件，温度是其中之一。温度变化可以使细胞膜的流动性与通透性发生改变。相较正常细胞，肿瘤细胞膜流动性较强，更易受温度变化影响。热疗利用肿瘤细胞这一特性，使镶嵌在细胞膜脂质双层中的抗原决定簇暴露，从而增加肿瘤细胞的抗原性。同时肿瘤细胞流动性增强，还可以使化疗药物更易进入细胞，增强化疗疗效。根据加热温度可将热疗分为温热治疗（41℃～45℃）和热消融（＞55℃），温热治疗条件下细胞死亡以凋亡为主[5，6]。研究表明温热治疗通过激活Caspase 家族诱导不可逆的细胞凋亡[7]。热消融温度下以坏死为主，与细胞凋亡不同，细胞坏死时细胞膜结构被破坏。

免疫原性细胞死亡（Immunogenic cell death，ICD）是一种由某些化疗药物、溶瘤病毒、物理化学疗法、光动力疗法和放射疗法引发的肿瘤细胞死亡。死亡细胞由非免疫原性转化为免疫原性，引起免疫应答，使抗肿瘤免疫反应增强。细胞受到刺激发生ICD 时，可产生新的抗原表位并释放DAMPs。DAMPs 包括细胞表面暴露的钙网蛋白（ecto-CRT）、HMGB1、HSP70 和三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP），能够和抗原提呈细胞（Antigen presenting cell，APC）结合（如与DCs 结合），使其识别、吞噬死亡细胞抗原，将抗原呈递给T 细胞，激活适应性免疫应答[8]。研究证明，热疗诱导的细胞凋亡一定程度上促进ICD 的发生，其中产生的凋亡、坏死的细胞碎片也可作为抗原，从而诱导特异性抗肿瘤免疫反应[8，9]。一项鼠三阴性乳腺癌4T1 细胞模型上的研究结果显示，与临床上外源性热疗不同，磁热疗（Magnetic hyperthermia，MH）将氧化铁纳米剂作为加热源，外加交变磁场加热细胞内区域，直接刺激细胞ICD 的发生[9]。

在肿瘤的发生、发展过程中，肿瘤细胞的转移现象始终存在。热疗可直接作用于肿瘤细胞或间接提高机体的抗肿瘤免疫，抑制肿瘤细胞转移[10]。此外，全身热疗或热疗联合化疗可以有效协同杀灭转移的癌细胞。因此，热疗与放疗或化疗结合可提高放化疗疗效。

1.3 改善缺氧和诱导活性氧产生活性氧（Reactive oxygen species，ROS）由机体内氧原子在捕捉电子后形成，在细胞的生长、分化和增殖过程中发挥重要作用，其水平在正常细胞中处于一个较为稳定的范围。相较于正常细胞，肿瘤细胞中的ROS 产生更多，ROS 通过使原癌基因激活、抑癌基因失活、线粒体功能受损以及代谢水平升高等方式在肿瘤发生、发展、分化、转移等各个阶段发挥不同的作用。Hou等[11]研究证实，随着热疗时间增加，细胞内ROS 含量升高。应激活化蛋白激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）通路是实现细胞凋亡的重要通路之一，其活性升高会诱导细胞凋亡发生[12]。热疗通过诱导ROS 产生，继而激活JNK 信号转导通路和抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT）通路活化，诱导细胞凋亡，是肿瘤治疗的新思路[13]。ROS 也为引起蛋白变性的常见物质[14]，可引起蛋白质主链断裂、蛋白质羰基化及蛋白质-蛋白质交联从而使其失去活性导致细胞功能异常。

2 肿瘤免疫微环境重编程

肿瘤免疫微环境（Tumor microenvironment，TME）是由免疫细胞、成纤维细胞等细胞与细胞外基质及各类信号分子等组成的复杂网络系统，是肿瘤发生及生长的微环境。见表1。肿瘤细胞和周边微环境之间的相互交流和作用是肿瘤生长、进展、转移的重要因素[15～18]。研究表明，39℃～40℃热刺激可以调节CD4+T 细胞的分化和成熟，纠正其功能失调，可抑制T 细胞向Th2 和调节性T 细胞（Treg）分化，促进T 细胞向Th1 和Tc1 细胞分化成熟。同时热刺激下IL-6 因子分泌升高促进Treg 分化为Th17[19]。也有研究证明热疗促进记忆T 细胞的产生增多[20]，CD8+记忆T 细胞通过识别肿瘤细胞上的特定抗原并刺激免疫反应来杀死肿瘤细胞。记忆免疫的长期作用有助于控制肿瘤复发和延长生存期。在热刺激的作用下，诱导肿瘤细胞表面DAMPs 的表达增多[21]。在DAMPs 作用下，TME 中免疫激活亚型的免疫细胞数量和NK 细胞的肿瘤杀伤能力显著增强。

表1 肿瘤免疫微环境的组成

2.1 固有免疫反应固有免疫是机体抵御常见病原体的第一道防线，在抗肿瘤免疫中也发挥监测作用。固有免疫细胞主要包括DCs、巨噬细胞和自然杀伤细胞（Natural killer cell，NK 细胞）。NK 细胞是固有免疫系统中发挥细胞毒性作用的淋巴细胞，而NKG2D 是NK 细胞上最重要的活化性受体之一，可识别靶细胞表面的配体NKG2DL 对靶细胞发挥杀伤作用。NKG2DL 从肿瘤细胞表面脱落是肿瘤免疫逃逸的一种关键机制[22]。

MICA/B 是一类常见的NKG2DL，属于组织相容性复合体（Major histocompatibility complex，MHC）I 类多肽相关蛋白，在正常细胞中不表达或低表达（如肠上皮细胞），主要在受损、感染或转化的细胞（如乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、黑色素瘤细胞等肿瘤细胞）表面表达，可以与NKG2D 结合，调控NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性作用，是肿瘤免疫治疗的潜在靶点[23]。研究证明，HSP70 和MICA 可以协同激活NK 细胞的细胞毒性效应功能。肿瘤细胞MICA 的表达上调，同时热应激引发HSP70 上调[24]，共同激活NK 细胞[25]。热应激也会上调DCs 及巨噬细胞上Toll 样受体4（TLR4）并诱导细胞因子、趋化因子和NO 的释放，诱发炎症反应，从而促进适应性免疫反应[26]。

2.2 适应性免疫反应热刺激主要通过激活T 细胞促进适应性免疫反应，主要通过以下几条路径：①热刺激可上调lmp2、lmp7[27]的表达，增强免疫酶体蛋白依赖性表位的表达，提高肿瘤免疫原性[28]，并且诱导未折叠蛋白反应，增加HSPs 在肿瘤细胞[29]中的表达。HSPs 与APC 上的HSP 受体相互作用，生成HSP+外泌体和HSP -肽复合物从肿瘤细胞中释放出来，并通过HSP 受体[30]被APC 识别并摄取。最后通过MHC 在APC 上呈递肿瘤抗原性肽以刺激T 细胞。②热刺激也上调MHC-I 及APC 上的MHC-II、CD80、CD86、CD40 的表达并增强APC向淋巴结迁移，从而激活T 细胞[31]。③热刺激还通过增加c-FLIP 的消耗来控制淋巴细胞的持久性并诱导高内皮微静脉上的ICAM-1 和CCL21 的表达，可促进T 细胞向外周组织的运输[32]。

3 肿瘤血管基质细胞重编程

肿瘤的生长与转移除了与肿瘤细胞分化程度有关，也与血管对周细胞（Pericytes，PCs）的募集作用有关[33]。PCs 为一种血管周基质细胞，与血管的稳定性密切相关。包括血小板衍生生长因子（Platelet-derived growth factor subunit B，PDGF-B）、促血管生成素1（Angiopoietin-1，Ang-1）在内的多种因子会促进血管对PCs 的募集。但这些肿瘤血管PCs 仍然缺失或分离，并不能与血管壁稳定结合[34]。Ang-1/Tie2 为促进PCs 募集的重要信号。PCs 参与Ang-1 的产生，而通过Ang-1/Tie2 可抑制内皮细胞的活动从而促进血管的稳定。研究证明内皮细胞可分泌促血管生成素2（Ang-2），竞争性结合Tie2拮抗Ang-1 的作用[35]。Ang-2/Tie 2 可促使内皮细胞与PCs 之间的连接变得疏松，从而使肿瘤的转移能力增强。有研究证明通过抑制Ang-2 通路，可促进血管对PCs 的募集，从而抑制肿瘤的生长、转移[36]。

未经治疗的肿瘤血管较正常组织血管有PCs分离、血管直径大、密度异常等特点，其异常主要由VEGF 和Ang-2 水平升高所致。VEGF 在正常组织中可维持血管内皮与PCs 的稳定。也有研究表明，VEGF 的过表达使血管通透性增高，阻断其受体VEGFR-2 可以维持血管静水压力梯度，加强药物在肿瘤中的渗透[37]。

VEGF 为抗血管靶向药物贝伐珠单抗、舒尼替尼、帕唑帕尼的共同靶点。一方面抑制肿瘤血管生成，另一方面促进肿瘤血管基质细胞重编程。而肿瘤血管基质细胞重编程是促进血管正常化的细胞学基础，可以改善血管形态，促进肿瘤间质压力恢复正常。血管正常化过程包括血管PCs 覆盖增加、血管灌注改善、血管通透性降低、缺氧减轻，从而抑制肿瘤的进展。研究证明，在人卵巢癌小鼠异种移植模型（SKOV-3）中，与安慰剂相比，贝伐珠单抗可增加血管周细胞覆盖，诱导血管正常化[38]。通常肿瘤的血管渗漏会导致肿瘤组织间质液压（Interstitial fluid pressure，IFP）增加。一项针对人小细胞肺癌54A、人多形性胶质母细胞瘤U87 裸鼠模型的研究显示，DC101 作为一种抗VEGFR-2 单克隆抗体，可促进内皮细胞在基底膜上分布，增加血管壁新生，促进血管形态正常化；同时降低IFP，促进血管功能正常化[39]。在病理性血管组织中，抗血管生成药物可改善血管形态，促进IFP 恢复正常，由此可增加药物在肿瘤组织中的分布，其与化疗药物联合可相辅相成，如VEGF 单抗增加伊立替康在肿瘤组织中的分布，并显著增加肿瘤灌注；过表达PDGF-D 促进血管正常化也可增加化疗药物在肿瘤组织中的分布[40]。

4 基于免疫治疗联合治疗模式探索

4.1 免疫检查点抑制剂免疫治疗已成为晚期恶性肿瘤的重要治疗方式，程序性细胞死亡蛋白-1（Programmed cell death-1，PD-1）与肿瘤细胞上的配体PD-L1 结合，抑制T 细胞作用和功能，从而使肿瘤细胞回避免疫应答，逃过免疫杀伤效应，在肿瘤的宿主免疫逃逸机制中发挥重要作用。免疫检查点抑制剂（Immune checkpoint inhibitors，ICIs）为肿瘤免疫治疗的重要组成部分，ICIs 已经用于非小细胞肺癌、肾细胞癌及黑色素瘤等肿瘤的一线治疗[41～43]。临床常用的ICIs 是PD-1/PD-L1 单抗及CTLA-4 单抗。目前新靶点也在不断研究之中，而主要在激活的T 细胞、B 细胞和NK 细胞表面表达的LAG-3 是最受关注的靶点之一。靶向LAG-3 的瑞拉利单抗（Relatlimab）已被批准用于晚期黑色素瘤的治疗，特别是用于治疗PD-L1＜1%和/或LAG 3 ≥1%的患者，其PFS 有显著改善[44]。

但是单一的ICIs 在临床治疗中的治疗效果有限，总体的临床反应率为15%～60%[45]，并且由于肿瘤复杂的免疫逃逸机制，ICIs 仅对部分患者有效，其疗效与肿瘤微环境密切相关。低应答率和免疫相关不良事件（irAEs）限制了 ICIs 的临床应用[46]。

4.2 热疗联合治疗模式PD-1/PD-L1 为ICIs 的主要靶点。研究证明，较单用放疗，放疗联合热疗的乳腺癌细胞在39℃、41℃和44℃热刺激120h 后，PD-L1、PD-L2 和HVEM 表达均显著增加。证实热疗可提高肿瘤PD-L1 表达，从而提高对ICIs 的应答[47]。也有研究表明，热疗可以显著改变肿瘤的免疫微环境：热疗产生的ICD 效应可以增加细胞对ICIs 敏感性[48]。目前，许多使用热疗结合ICIs 治疗的基础实验和临床研究在进行中，并显示出克服上述ICIs 局限性的可能性，展现出极大的应用前景。

热刺激对血管的作用在于对血管的破坏和抑制血管的再生。热刺激作用于肿瘤血管内皮细胞抑制其合成及分泌VEGF，从而抑制肿瘤血管形成，控制肿瘤生长。血管内皮细胞较肿瘤细胞不易突变，因而很少产生耐药性。此外热疗还具有放大效应。通过人体正常的热调解作用，正常组织加热以后能够很快散热，而肿瘤组织的血管分布较为杂乱，加热后热度并不能像正常组织一样快速分散，而持续存在，这样热刺激得以持续发挥作用。通过化疗、精准放疗、免疫治疗与热疗相联合，形成热疗联合多学科诊疗模式，使治疗疗效持续作用于肿瘤组织。目前基于纳米材料的微波热疗平台也取得了有效进展，经过CmHSP70 修饰的金纳米颗粒靶向聚集于肿瘤，可高效转化热能，使光热疗法更精准、更可控、更高效，也降低了对正常组织的损伤[49]。

4.3 抗血管药物联合治疗模式抗血管酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors，TKI）单用可促进肿瘤血管正常化，抗血管TKI 组治疗9 天PCs覆盖增多，无明显内皮细胞弥散。抗血管TKI 联合PD-1 抗体治疗至21 天，PCs 覆盖仍保持，无明显内皮细胞弥散[50]。安罗替尼作为多靶点TKI，可抑制三种主要的促血管生成因子受体（VEGFR、PDGFR 和FGFR）[51]，不仅可以显著抑制肿瘤新生血管，还可以改变肿瘤血管基质，促进血管正常化，从而改善血管形态和肿瘤血液灌注，使得血管渗漏减少，缺氧缓解，促进肿瘤间质液压恢复正常，进而增加化疗药物在肿瘤组织中的分布，进一步加强抗肿瘤效果。

抗血管药物与免疫治疗联合也可增加抗体药物在肿瘤组织中的分布，如使用阿昔替尼后，纤维蛋白外渗区域在肿瘤内更为丰富[52]。VEGFR-TKI特异性递送PD-1 单抗至肿瘤组织，且不会增加派安普利单抗在正常组织中的分布[53]。

有研究证实抗血管药物与化疗联合可增加化疗药物在肿瘤组织中的分布，如VEGF 单抗增加伊立替康在肿瘤组织中的分布，并显著增加肿瘤灌注[54]。贝伐珠单抗可增加拓扑替康、依托泊苷在肿瘤组织中的分布[55]。舒尼替尼可增加替莫唑胺在肿瘤组织中的分布[56]。沙利度胺可增加环磷酰胺在肿瘤组织中的分布[57]。

5 总结与展望

热疗可以抑制肿瘤生长和转移，增强免疫细胞浸润，调节抗肿瘤/促肿瘤免疫细胞比例和细胞因子水平；抗血管药物可抑制肿瘤血管生成，通过促进肿瘤血管基质细胞重编程，促进血管正常化。综上所述，热疗和抗血管治疗均可改善肿瘤组织缺氧，联合免疫治疗可协同增效；均可降低肿瘤组织间质压力，增加药物在肿瘤组织中的分布；均可改善肿瘤组织缺氧，协同免疫治疗，提升疗效。虽然他们均可以有效抑制肿瘤生长，但是并不能完全作为治疗肿瘤的独立方案。联合治疗模式仍有很多问题有待解决：①缺乏有效的疗效预测指标，以精准确定目标人群；②如何选择合适的联用方案（单用/联用）；③如何确定合适的治疗时机及模式（同时/序贯、每天/每周、全身/局部）。对此我们仍需要开展更多的基础及临床研究，探究有效的疗效预测生物标志物，以明确目标人群，确定最佳联合疗法及用药最佳时间、最佳剂量。