朝天委陵菜DSE的分离鉴定及动态生长特性

吴艳清,白菁华,刘沺沺

(保定学院 生物化工与环境工程学院,河北 保定 071002)

深色有隔内生真菌(dark septate endophytes,DSE)是一类广泛定殖于植物根部并与植物共生的小型丝状真菌,能够促进植物生长,提高抗逆能力[1],在与药用植物共生过程中能够加强植物合成与积累药用成分[2],或活化药用成分进而提升功效[3],甚至其自身部分次生代谢产物就是药用活性物质[4],在提高药用价值方面发挥重要作用.朝天委陵菜(Potentillasupina)是蔷薇科(Rosaceae)委陵菜属(Potentilla)1～2年生草本植物,分布广泛,用途多样,除食用外被广泛用作民族药,临床上用于治疗糖尿病和细菌性痢疾等症[5],药用价值很高.但迄今为止,仅见有委陵菜与丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AM)的少量相关报道,如根内球囊霉(Rhizophagusintraradices)对钝裂委陵菜(P.chinensis)具有促生作用[6],黑球囊霉(Glomusmelanosporum)能够减轻盐碱对鹅绒委陵菜(P.anserina)的胁迫伤害[7],摩西球囊霉(Funneliformismosseae)能够增强绢毛委陵菜(P.sericea)的耐镉能力[8],但鲜见委陵菜与DSE之间相互关系的研究,其根内有无DSE定殖也不清楚.此外,有研究指出AM与DSE在植物体内的定殖存在生态位竞争关系[9].本文对朝天委陵菜根内DSE的定殖状况进行观察,对其中的DSE进行了分离纯化和鉴定,并明确其中1株DSE真菌的动态生长特性,为研究微生物-植物互作提供研究思路,同时也为DSE菌种的开发及应用奠定基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料

朝天委陵菜采自河北省保定市郊区自然生境(38°52′ N,115°34′ E),随机选取10个样方(2 m×2 m),每个样方采集3株正常健康生长的植株,取根部用流水洗去泥沙杂质,切成1.0 cm×0.2 cm根段,4 ℃保存用于DSE镜检和菌种分离.

1.2 DSE菌株定殖镜检

每个样方随机选取25个根段,共计250个根段,经体积分数为75%的乙醇消毒处理和无菌水清洗后,于100 ℃下水浴30 min以去除根皮细胞中的细胞质,接着用质量分数为0.5%的酸性品红染色固定,再经体积分数为95%的乙醇脱色和无菌水清洗后,置于光学显微镜下镜检,观察DSE在朝天委陵菜根部的定殖情况,并统计DSE定殖率.定殖率计算公式为

1.3 DSE菌株分离和纯化

另随机选取54个根段,经质量分数为8%的NaClO和体积分数为75%的乙醇消毒处理,并用无菌水清洗后,接种于PDA(马铃薯蔗糖培养基)上,每平皿6个根段,共接种9皿,置于28 ℃下暗培养5～7 d.待根段周围长出菌落后,挑取菌落边缘菌丝体接种在新鲜PDA上,重复转皿培养3次以纯化菌株.

1.4 DSE菌株形态学和分子生物学鉴定

对分离纯化出的DSE真菌中生长状态最好的菌株,根据DSE菌株在PDA上的培养特性、菌落、菌丝体和分生孢子等特征,参考《真菌鉴定手册》和《中国真菌志》进行形态学鉴定.同时,采用Ezup柱式真菌基因组DNA试剂盒提取基因组DNA,利用rDNA-ITS序列(rDNA internal transcribed spacer)进行鉴定.扩增引物序列为ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′.PCR扩增产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序.序列经BioEdit软件分析后,用NCBI-Blast进行序列同源性比对,以小孢根霉(Rhizopusmicrosporus)为外群,采用邻接法(NJ)构建系统发育树.

1.5 DSE菌株动态生长特性观察

将分离纯化并鉴定的DSE菌株接种在PDA上28 ℃暗培养,记录其在固体培养基上的表观动态生长特性;同时将DSE菌株接种在PDB(马铃薯蔗糖培养液)中28 ℃、120 r/min振荡培养,记录其在液体培养基中的表观动态生长特性,并取适量菌液在显微镜下定时镜检,记录微观动态生长特性.

2 结果与分析

2.1 DSE定殖状况

镜检发现,DSE菌丝通过侵染点从根尖部位侵入皮层细胞间隙生长 (图1a),或延伸至皮层细胞内形成胞内菌丝 (图1b).在根段表皮细胞中可见由膨大的菌丝紧密堆积形成的微菌核结构,颜色较深 (图1c).在朝天委陵菜的250个供检根样中,有148个根样出现DSE菌丝定殖现象,定殖率为59.2%;其中26个根样含有DSE微菌核,定殖率为10.4%.

a.DSE菌丝侵染植物根系;b.DSE形成胞内菌丝结构;c.DSE形成微菌核结构图中E为侵染点,h为菌丝,m为微菌核图1 朝天委陵菜根部DSE菌株定殖结构Fig.1 Dark septate endophyte structures formed in the root of Potentilla supina

2.2 DSE菌株分离纯化

应用组织分离法和菌丝尖端挑取法,从54个根样中经3次分离纯化得到朝天委陵菜内生真菌菌株共19株,编号分别为CTW-1至CTW-19,通过形态学观察可将上述内生真菌分为7个种类.依据菌落及菌体形态特征初步判断CTW-3、CTW-6、CTW-7、CTW-9、CTW-10、CTW-12、CTW-14、CTW-15和CTW-17等9株内生真菌为DSE真菌,其余10株内生真菌菌落表面具有其他属种的特征纹饰(梯田纹、同心轮纹、粉末状、斑状等),菌丝颜色较浅且无隔,均为非DSE真菌.与其他几类内生真菌相比,DSE真菌检出频率最高,表明DSE真菌是朝天委陵菜内生真菌优势种.

2.3 CTW-9菌株形态学鉴定

从上述分离纯化得到的DSE菌株中,选取生长状况最为良好的CTW-9菌株进行纯培养.该菌株在PDA上菌落初期为白色,成熟后呈褐色至黑色,菌丝暗色或褐色,较为粗壮,具横隔,多分枝;分生孢子单生或链生,倒棍棒状或纺锤状,具有纵/斜隔和横隔膜 (图2).参考《真菌鉴定手册》和《中国真菌志》等,发现CTW-9菌株的菌落及菌体特征与子囊菌门(Ascomycota)、座囊菌纲(Dothideomycetes)、格孢腔菌目(Pleosporales)、格孢菌科(Pleosporaceae)、链格孢属(Alternaria)真菌比较接近,初步将其归为链格孢属.

a.CTW-9菌株菌落形态;b.CTW-9菌株菌丝形态;c.CTW-9菌株分生孢子形态图中h为菌丝,c为分生孢子图2 CTW-9菌株形态特征Fig.2 Morphological characteristics of CTW-9

进一步将CTW-9菌株的部分特征与链格孢属真菌模式种细极链格孢(A.tenuissima)、链格孢(A.alternata)和危害较为广泛的茄链格孢(A.solani)[10]等近似种进行比较 (表1),发现其与A.alternata的形态特征最为相近,因此初步判断CTW-9菌株为A.alternata.

表1 CTW-9菌株与其近似种的形态特征比较

2.4 CTW-9菌株的分子生物学鉴定

CTW-9菌株经rDNA-ITS序列通用真菌引物PCR扩增后,获得的序列长度为541 bp (图3a).将此序列与GeneBank中的已知序列进行比对,以小孢根霉(R.microsporus,MT620751)为外群,选取相似度较高的序列构建系统发育树.经NCBI-Blast比对和系统进化特征分析表明 (图3b),CTW-9菌株的rDNA-ITS序列与A.alternata聚合在同一支,且相似度均大于99%.结合形态学鉴定结果,进一步确定CTW-9菌株为链格孢(AlternariaalternataKeissler),GeneBank登录号为MT451845.

a.CTW-9菌株rDNA-ITS序列PCR产物;b.CTW-9菌株rDNA-ITS序列系统发育树图中Alternaria sp.为链格孢菌未定种,Pleosporales sp.为格孢腔菌未定种,Dothideomycetes sp.为子囊菌未定种,外群(outgroup)为小孢根霉(Rhizopus microsporus,MT620751)图3 基于rDNA-ITS序列构建的CTW-9菌株系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of CTW-9 based on rDNA-ITS sequences

2.5 CTW-9菌株动态生长特性

将CTW-9菌株分别在PDA上和PDB中培养并定时观察,发现其均可正常生长并完成生活史,菌丝初期为白色,成熟后为深色.对PDB中培养的菌体定时镜检,发现:在培养第3天,白色无隔菌丝卷曲缠绕形成空心菌丝球,渐变为乳黄色至黄色,并形成哈氏网结构;第4天菌丝大量生长,第5天菌丝变为深褐色并出现横隔,其顶生或侧生类似泡囊的卵圆形透明结构,分生孢子附近出现类似土生辅助细胞的结构;第6天分生孢子大量形成,具壁砖状隔膜特征,分生孢子梗断裂产生链式分生孢子,类泡囊成熟破裂产生单生分生孢子 (图4).

3 讨论与结论

DSE是一类发现较早且分布广泛的内生真菌,与植物建立的“植物-DSE”共生体系从分子水平到个体水平都参与发挥生物学功能.在药用植物中,DSE具有丰富的物种多样性,刘燕等[11]从红豆树根围分离得到5株DSE,其中AcrocalymmavagumD02菌株和Leptosphaeriasp.D04菌株均对红豆树幼苗具有促生作用;陈思杰[12]从枸杞根围分离得到41株DSE,经鉴定归属于6属8种,其中CladosporiumcladosporioidesS12菌株等8株DSE对枸杞根腐病具有防治功效.本研究从朝天委陵菜根部分离纯化出9株DSE,通过菌株的培养特性和菌体形态特征初步判断,朝天委陵菜根部的DSE也具有物种多样性迹象.

研究DSE在常规培养条件下的动态生长特性,有助于明确DSE对宿主植物的定殖过程,为优化菌株培养方式提供实际参考.截至目前,有关DSE在常规培养条件下的动态生长特性鲜见报道.本研究较为系统地研究了CTW-9菌株的动态生长特性,在接种后的前3 d,菌种处于适应阶段(迟缓期),CTW-9菌株主要进行营养摄取;4～6 d为菌种的生长阶段(对数期),CTW-9菌株生长并积累黑色素;第6天后为菌种的生产阶段(稳定期),CTW-9菌株成熟和繁殖,产生大量分生孢子.这些结果将为后续优化CTW-9菌株的培养时间和培养条件,在确定时间段内获得优质菌丝体、分生孢子和次生代谢产物,以及为明确CTW-9菌株在朝天委陵菜根部的定殖过程和形成特殊结构的准确时间等方面提供实际参考.

微菌核是DSE的休眠繁殖结构,推测其与菌丝可以相互转化,即在不利环境下,DSE菌丝紧密堆积形成微菌核;环境适宜时,微菌核重新萌发产生菌丝.O’Dell等[13]和Fernando等[14]分别在接种福廷瓶头霉(Phialocephalafortinii)的扭叶松和垂柳根部发现哈氏网结构,并指出哈氏网是DSE与宿主植物进行营养物质交换的场所.本研究在对CTW-9菌株进行发酵培养时,发现菌丝通过形成透明无隔的哈氏网与PDB培养液建立营养关系,这与文献[13]和文献[14]的报道一致,因此认为哈氏网是DSE与宿主植物形成共生体系的重要特征结构.本研究在纯培养的CTW-9菌丝上首次观察到大量类似泡囊的结构,能够采取破裂的方式产生分生孢子,推测其可能是CTW-9菌株在一定时期内的特化繁殖结构,而泡囊是由菌丝末端膨大形成的椭圆形结构,在AM真菌中较为常见,具有贮藏和繁殖功能[15].土生辅助细胞含有大量脂肪和内容物,在真菌生活史中的作用尚不明确[15],本研究仅在纯培养的CTW-9菌丝球内部观察到类似土生辅助细胞的结构,推测其能够为分生孢子产生外延菌丝提供营养.

A.alternata是一个普遍存在的真菌种,在印度西高止山脉的臭味假柴龙树[16]、智利阿塔卡马沙漠盐湖的藜麦[17]、阿根廷潘帕斯草原的小麦[18]、中国西北地区的油蒿[19]等植物中也分离得到过.陈思杰[12]发现A.alternata是枸杞根系内生真菌的优势种,M1菌株能够防治由尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)引起的枸杞根腐病;周兵等[20]通过研究A.alternataN菌株的次生代谢产物,发现其对禾谷镰孢菌(F.graminearum)引起的小麦赤霉病、稻瘟菌(Magnaporthegrisea)引起的水稻稻瘟病、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)引起的油菜菌核病、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)引起的烟草灰霉病和群生小穴壳(Dothiorellagregaria)引起的杨树溃疡病均产生不同程度的抑制效果;Devari等[21]从辣椒中分离出A.alternataFC-46菌株,其次生代谢产物alternariol-10-methyl ether对癌症细胞具有抑制作用;卢丹丹等[22]从北桑寄生叶片中分离出A.alternataBS27菌株,其次生代谢产物alternariol-5-O-methyl ether和cis,cis-9,12- octadecadienoic acid对大肠杆菌(Escherichiacoli)等耐药菌具有抑菌能力;Zhao等[23]从紫荆中分离出A.alternataZHJG5菌株,其次生代谢产物4-hydroxyalternariol-9-methyl ether、isotalaroflavone和verrulactone A对青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)和稻黄单胞菌(Xanthomonasoryzae)表现出明显的抑菌活性,表明从不同宿主植物中分离得到的同一种DSE具有功能多样性.有研究发现,内生真菌与药用宿主植物协同进化,能够合成与宿主植物相同或相似的生物活性物质[24].朝天委陵菜在临床上可用于治疗糖尿病和细菌性痢疾,本研究中CTW-9菌株及其代谢产物与朝天委陵菜中药用成分之间的关系有待进一步探讨.