玉屏风口服液多糖特征降解谱的建立和应用

马梦楠,张钰,李欣珂,刘进宝,刘丹,郭怀忠,2

(1.河北大学 药学院,河北 保定 071002;2.河北省药物质量分析控制重点实验室,河北 保定 071002)

玉屏风方最早以散剂的形式记载于《丹溪心法》,由黄芪、白术(炒)和防风三味药材制备而成,具有补益肺卫、祛风散寒的功效[1],现代研究表明其还具有显著的免疫调节作用[2-3].玉屏风方常见剂型有颗粒剂、胶囊、口服液和散剂等,其中玉屏风口服液生产厂家众多,主要工艺是首先提取出防风挥发油,再将三味药材煎煮,滤液经醇沉、浓缩后,添加防风挥发油和辅料蔗糖混匀制得,其质量标准采用高效液相色谱法(HPLC)测定黄芪甲苷的含量[4].该口服液中黄芪甲苷[5]、升麻素苷[6]和5-O-甲基维斯阿米醇苷[7]等成分的测定多有报道,有关颗粒剂等其他玉屏风制剂的质量研究也多集中于上述成分的测定[8-9].

玉屏风多糖是一种复合多糖,作为玉屏风方的主要药效物质,与黄芪多糖、白术多糖和防风多糖一样,具有保肝、抗衰老、抗肿瘤和免疫调节等[10-13]多种活性.近年来,以多糖特征图谱对单味药材或单方制剂进行质量分析的研究逐渐增多.曹宇欣等[14]基于部分酸水解-亲水作用色谱建立了黄芪多糖特征图谱,发现不同产地黄芪寡糖相对峰面积差异较大,可用于不同产地黄芪药材的鉴定.张建等[15-16]基于多糖部分降解图谱先后对单方制剂板蓝根颗粒和发酵虫草菌粉进行了鉴定,发现不同厂家样品谱图差异明显,表明不同厂家产品质量差异显著.

单味药材或单方制剂样品指纹图谱的对照谱图,一般通过中位数法采用所有样品的指纹图谱生成,但中药复方制剂中所采用药材的来源不同可能会使不同厂家产品差异较大.本文尝试对不同来源的黄芪、白术(炒)和防风药材按照正交设计原理进行组合后制备模拟玉屏风口服液,并综合得到玉屏风口服液多糖(YPF-P)特征降解谱对照谱图,用于实际样品中多糖成分质量控制的参考,为中药复方制剂多糖的质量评价进行一定的方法学探索.

1 仪器与试药

1.1 仪器

DF-101S型恒温加热磁力搅拌器、SHB-3型多用真空泵(保定高新区阳光科教仪器厂);RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);XMTB型恒温水浴锅(余姚金电仪表有限公司);CL1020型高效毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器有限公司);BT25S型电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司);PHS-3C型酸度计(上海理达仪器厂);L420型台式低速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);CT15RT型高速冷冻离心机(天美(中国)科学仪器有限公司).

1.2 试药

D-葡萄糖(Glu,天津市福晨化学试剂厂);D-核糖(Rib,北京博奥拓达科技有限公司);L-鼠李糖(Rha,合肥博美生物科技有限公司);D-阿拉伯糖(Ara)、D-甘露糖(Man)、D-半乳糖(Gal)、D-半乳糖醛酸(GalA)均购自北京索莱宝科技有限公司;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP,上海阿拉丁生物科技有限公司);硫脲、氢氧化钠等均为分析纯;水为纯化水;玉屏风口服液为市售,具体信息见表1.

表1 玉屏风口服液样品信息

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.) Hsiao的干燥根,白术(炒)为菊科植物白术AtractylodesmacrocephalaKoidz的干燥根茎,防风为伞形科植物防风Saposhnikoviadivaricate(Turcz.) Schischk.的干燥根,3味药材均经河北大学药学院生物药学教研室周程艳副教授鉴定,具体信息见表2.

表2 药材信息

2 方法

2.1 电泳条件

未涂层熔融石英毛细管柱(50 cm×50 μm i.d.,有效长度41 cm);运行缓冲液:40 mmol/L硼砂缓冲液(pH 10.1);检测波长:245 nm;运行电压:10 kV;进样量:重力进样15 cm×20 s;柱温:室温.

2.2 YPF-P的提纯

利用不同相对分子质量糖类成分在一定溶剂中溶解度不同的原理,比较不同体积分数乙醇沉淀得到YPF-P,同时去除玉屏风口服液辅料蔗糖的效果,发现采用体积分数70%乙醇沉淀多糖得率高且可有效去除蔗糖的影响.具体操作如下:取玉屏风口服液2.0 mL,体积分数70%醇沉,4 ℃静置过夜,4 000 r/min离心5 min,沉淀加适量水复溶,转移至5 mL量瓶中,定容,摇匀,得YPF-P溶液.

2.3 YPF-P部分降解条件优化

取上述YPF-P溶液2.0 mL,加入相应浓度的盐酸溶液2 mL,使反应体系中的盐酸达到目标浓度,密封,在一定的温度中降解一定时间,放冷,中和,加入5 mg/mL硫脲(内标)溶液0.4 mL,转移至5 mL量瓶中,加水定容,摇匀,得YPF-P部分降解液.

取YPF-P部分降解液0.2 mL,置1.5 mL离心管中,加入0.3 mol/L氢氧化钠溶液0.1 mL和0.5 mol/L PMP甲醇溶液0.1 mL,混匀,70 ℃水浴30 min,放冷,加入0.3 mol/L盐酸溶液0.1 mL中和,加入三氯甲烷1 mL,涡旋1 min,静置1 min,12 000 r/min离心3 min,取上清液,按2.1项下电泳条件进行测定,得样品YPF-P特征降解谱.

2.4 模拟YPF-P特征降解谱的建立

玉屏风口服液生产厂家众多,3种原料药材的来源往往不同.为考察相关差异和生成对照谱图,取不同来源的黄芪、白术(炒)和防风药材各3批,设置为3个水平,见表3.借助正交设计实验组合的代表性,按L9(34)得到9种药材组合,参考药典工艺[4]制备模拟玉屏风口服液,见表4.取各模拟口服液样品2.0 mL,依照上述条件进行YPF-P的提纯、部分降解、衍生和测定,得到模拟样品YPF-P特征降解谱.

表3 正交实验因素水平表

表4 正交实验设计表

2.5 YPF-P特征降解谱的应用

测定样品S1～S16的YPF-P特征降解谱并对其进行聚类分析.

3 结果

3.1 YPF-P部分降解条件

部分降解条件单因素考察结果见图1.由图1可知,以峰数目和峰面积比(寡糖总峰面积与内标峰面积之比)为考察指标,盐酸溶液浓度、温度和时间对多糖部分降解的影响均呈现先升高后降低的趋势,说明条件过弱使多糖降解不充分;条件过强时降解过于剧烈,得到寡糖较少.最佳降解条件为体系中盐酸溶液浓度0.5 mol/L时80 ℃降解4 h.

图1 盐酸溶液浓度(a)、温度(b)和时间(c)对多糖部分降解的影响Fig.1 Effects of hydrochloric acid concentration (a), temperature (b) and time (c) on partial degradation of polysaccharides

3.2 方法学考察结果

3.2.1 精密度

取模拟玉屏风口服液(编号9),按2.4项下方法制备供试品溶液,按2.1项下电泳条件连续测定5次,以内标峰为参照峰,计算各共有峰相对迁移时间和相对峰面积的RSD.各共有峰相对迁移时间的RSD为0.8%～2.6%,相对峰面积的RSD为1.2%～3.4%.

3.2.2 重复性

取模拟玉屏风口服液(编号9),按2.4项下方法平行制备5份供试品溶液,按2.1项下电泳条件测定,以内标峰为参照峰,计算各共有峰相对迁移时间和相对峰面积的RSD.各共有峰相对迁移时间的RSD为0.5%～2.9%,相对峰面积的RSD为1.5%～4.2%.

3.2.3 稳定性

取模拟玉屏风口服液(编号9),按2.4项下方法制备供试品溶液,按2.1项下电泳条件,分别于0、2、4、8、16、24 h测定,以内标峰为参照峰,计算各共有峰相对迁移时间和相对峰面积的RSD.各共有峰相对迁移时间的RSD为1.1%～3.9%,相对峰面积的RSD为1.8%～4.7%.

方法学考察结果表明:该方法的精密度、重复性均良好,且供试品溶液在24 h内基本稳定.

3.3 模拟样品YPF-P特征降解谱的测定

用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”对模拟样品YPF-P特征降解谱进行分析,以编号9对应的图谱为参照,多点匹配后得到特征降解谱及对照图谱R见图2.由图2可知,9批样品除内标和PMP峰外共19个共有峰,1～13号为寡糖峰,14～19号为单糖峰,通过添加单一单糖对照品确定14～19分别为Glu、Rib、Rha、Man、Gal和GalA,Ara的迁移时间与14号峰Glu相近且二者含量均较高,未能被很好地分离.模拟样品特征降解谱提示,不同来源药材组合所得YPF-P特征降解谱的基本轮廓不尽相同,提示在工艺稳定的情况下,由不同来源药材生产的玉屏风口服液的多糖质量很可能本身即存在显著差异.

图2 模拟玉屏风口服液多糖特征降解谱Fig.2 Characteristic degradation profiles of polysaccharides in simulated Yupingfeng oral liquids

以内标峰为参照,计算9批口服液样品中各共有峰相对峰面积的RSD为35.6%～87.9%,波动较大.各模拟样品与对照图谱的相似度计算结果见表5,相似度为0.287～0.986.综上表明:各模拟口服液中多糖含量和组成差异较大.

表5 相似度计算数据

相似度计算结果表明:对照图谱与各样品的相似度整体上高于样品之间的相似度,表明对照图谱具有较高的代表性,可用于市售口服液样品YPF-P成分的质量控制.

3.4 玉屏风口服液YPF-P特征降解谱的测定

不同厂家玉屏风口服液代表性YPF-P特征降解谱如图3所示(省略3个批次).由图3a可知,同一厂家不同批次YPF-P特征降解谱基本相同,表明同一厂家的生产工艺和原药材选取较为稳定.由图3b可知,不同厂家口服液样品谱峰差异明显,表明产品质量从多糖角度评价差异较大,推测原因可能主要是不同厂家使用的原料药材来源不同.此外,玉屏风口服液的生产工艺中并未标明具体的醇沉浓度,只规定了“加适量乙醇使沉淀”,因此推测不同厂家也可能在生产中使用了不同的醇沉浓度,有关情况尚待探讨.

图3 2个厂家不同批次(a)和不同厂家(b)YPF-P特征降解谱Fig.3 Characteristic degradation profiles of YPF-P from different batches of the same manufacturer (a) and different manufacturers (b)

3.5 聚类分析

采用SPSS 26.0软件,以样品YPF-P特征降解谱中相应峰与内标峰面积的比值为变量,选用组间连接和夹角余弦法进行聚类分析,结果见图4.由图4可知,S1～S6、S7～S11两个厂家的产品可以很好地各自聚为一类,表明其各批次产品质量稳定.总体来看,所有样品聚为2大类,S1～S6、S7～S11和S17(对照图谱)聚为一类,其余样品聚为一类.结合图3发现,S1～S6、S7～S11和S17的多糖特征降解谱中各峰较为明显,而S12～S16的寡糖和一些单糖的含量均很低,提示该口服液的生产中,应对原料药材的选取和生产工艺的稳定给予足够重视.

图4 玉屏风口服液聚类分析Fig.4 Cluster analysis of Yupingfeng oral liquids

4 讨论

本文在其他条件一致的情况下,发现酸种类对YPF-P的部分降解效果有显著影响.通过对硫酸、盐酸、三氟乙酸和甲酸进行考察,发现使用盐酸时得到的多糖部分降解峰更丰富,谱图特征性更强,操作方便,可控性好,故最终选择盐酸.

同一中药因来源、炮制和生产工艺等因素的差异,使其质量一致性和临床疗效的稳定性受到影响.鉴于玉屏风口服液现行质量标准并未对其多糖成分进行控制,且发现多批次实际样品中多糖成分含量差异显著,标准对照谱图生成采用样品特征降解谱图的合理性欠佳.本文尝试采用正交设计原理,组合不同来源药材制备模拟玉屏风口服液样品,最终得到YPF-P特征降解对照谱图用于样品质量分析,并基于YPF-P特征降解谱建立了一种该药品的专属性鉴别方法,结合聚类分析,从多糖角度为该制剂的质量评价提供参考,有助于质量标准的完善.

针对不同来源药材所含成分不同的客观现象,制剂生产中可以采用“勾兑”的办法来保证终产品质量的一致性,该技术在银杏叶制剂金纳多的生产中已有成功应用,但应用于中药复方制剂保证其质量一致性会面临更多挑战[17].如何科学地获取和应用中药标准制剂开展中药质量和疗效一致性评价工作,将是实现中医药传承和发展的一个关键.