响应面法优化猫爪草多糖热浸提法提取工艺赫

丁轩 杨立军 徐源 刘敏杰 叶润 耿晓桐 李蕊 乔新荣

摘要 ［目的］优化猫爪草多糖热浸提法提取工艺。［方法］以猫爪草块根为原料，采用热水浸提法提取猫爪草多糖，选取提取时间、提取温度、液料比进行单因素试验，在单因素试验的基礎上，以猫爪草的多糖得率作为响应值，运用响应面法对猫爪草多糖热浸提法提取工艺进行优化。［结果］热浸提法提取猫爪草多糖最佳提取工艺是提取时间2.16 h、提取温度82 ℃、液料比38∶1（mL∶g），在此条件下，猫爪草多糖得率最高，为3.160%。［结论］该研究为猫爪草多糖的药理作用研究和进一步开发应用提供理论依据。

关键词 猫爪草；多糖得率；热浸提法；响应面法；提取工艺优化

中图分类号 R 284.2  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2023）23-0142-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.23.034

Response Surface Methodology to Optimize the Extraction Process of Ranunculi ternati Radix Polysaccharides by Hot Extraction Method

HE Ding-xuan， YANG Li-jun， XU Yuan et al

（School of Pharmaceutical Engineering， Xinyang Agriculture and Forestry University， Xinyang， Henan 464000）

Abstract ［Objective］ To optimize the extraction process of polysaccharides from Ranunculi ternati Radix by hot extraction method.［Method］Using the root tubers of Ranunculi ternati Radix as raw materials， the hot water extraction method was used to extract polysaccharides from Ranunculi ternati Radix. Single factor experiments were conducted by selecting extraction time， extraction temperature and liquid-solid ratio. Based on the single factor experiment， the polysaccharide yield of Ranunculi ternati Radix was used as the response value， and the response surface methodology was used to optimize the extraction process of Ranunculi ternati Radix polysaccharides using the hot water extraction method.［Result］ The optimal extraction process for extracting polysaccharides from Ranunculi ternati Radix using hot extraction method was extraction time of 2.16 hours， extraction temperature of 82 ℃， and liquid-solid ratio of 38∶1 （mL∶g）. Under these conditions， the highest yield of Ranunculi ternati Radix polysaccharides was 3.160%.［Conclusion］ This study provides a theoretical basis for the pharmacological study and further development and application of polysaccharides from Ranunculi ternati Radix.

Key words Ranunculi ternati Radix;Polysaccharide yield;Hot extraction method;Response surface methodology;Optimization of extraction process

基金项目 河南省科技攻关计划项目（222102310440，222102110247）；河南省高等学校重点科研项目（20A180028）；信阳农林学院青年基金项目（QN2021061）；信阳农林学院科研促进教学专项（kj-2021013）；信阳农林学院科技创新团队项目（XNKJTD-009）。

作者简介 赫丁轩（1992—），女，河南信阳人，讲师，博士，从事天然产物的提取与开发研究。*通信作者，副教授，博士，从事药学生物技术研究。

收稿日期 2023-01-12

猫爪草（Ranunculi ternati Radix）为毛茛科植物小毛茛（Ranunculus ternatus Thunb.）的干燥块根，因为其干根外形似一只猫爪且能够有效治疗人类鼠疮而因此得名［1］。关于猫爪草的最早书面使用记录是在《中药材手册》中，1955年《中国药典》将其重新收载。猫爪草主要在信阳地区上游生长，在长江下游及其他上游地区也有其广泛分布，若以猫爪草的主要有效成分猫爪草多糖糖苷为指标，则其原产地以河南信阳、驻马店地区为优［2］。猫爪草性味甘、性温、归经入肝、肺经，具有化痰止咳散结、解毒清热消肿的重要作用，可以广泛用于治疗疔疮病的肿痛，蛇毒绦虫咬伤、结核等［3］。猫爪草多糖为猫爪草活性成分之一，具有显著的药理作用，在很多临床研究中，猫爪草抗肝多糖药物具有强效抗恶性肿瘤、抗结核、抗慢性肝损伤、抗氧化、调节免疫等生物活性，它对肿瘤细胞有抑制作用，阻止其增殖分裂，对正常的细胞没有毒性作用，可以明显改善肝细胞损伤，具有保肝作用［4］。因此对猫爪草多糖提取条件的优化具有重要意义。

目前，猫爪草的生物提取方法主要有热水浸提法、回流浸提法、酶分解法、超声波提取等，其中热水浸提法是最传统的提取法，该法操作简单、提取多糖效率较高，并且对多糖成分的活性和其他成分的破壞影响较小［5］。响应面法（response surface methodology，RSM）指通过综合采用多元二次回归方程进行模拟化综合确定多个因素和多个响应值之间的一种函数响应关系，再对回归方程结果进行综合分析找出响应预测值和响应最优化值以及给出相应的最优试验条件，是以最少的试验人力资源消耗，在最短的试验时间内可得到发展更多、更好的生产经营成果最有效的技术研究方法，被广泛应用于优化提取工艺变量［6］。

该试验在对提取时间、提取温度、液料比进行单因素试验的基础上，以猫爪草多糖得率作为考察指标，采用响应面法分析优化猫爪草多糖热浸提法提取工艺，得到最佳且稳定的提取工艺参数，为猫爪草多糖相关制剂的开发和临床应用提供试验理论依据。

1 材料与方法

1.1 试材

所用猫爪草块根购自河南省信阳市中成药采购供应站。葡萄糖标准品（≥98％，中国药品生物制品检定所）；无水乙醇、浓硫酸、苯酚（分析纯，云南新蓝景化学工业有限公司）。

1.2 仪器

高速粉碎机（欣镇企业有限公司，型号6202）；电子天平（上海越平仪器有限公司，型号FA2004）；电热鼓风干燥箱（长葛市唯恒机械设备有限公司，型号101-0013）；恒温电热水浴锅（金坛市金城国胜实验仪器厂，型号HH B11 50）；高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司，型号HC-2062）；旋转蒸发仪（上海雅容生化仪器设备有限公司，型号RE-3000）；紫外可见光分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司，型号TU-1901）。

1.3 试验方法

1.3.1 葡萄糖标准曲线的绘制。

精密称取葡萄糖标准品0.020 g，用纯化水溶解，定容至100 mL，配制成0.2 mg/mL的葡萄糖标准溶液。准备7支干净的试管，按梯度吸取葡萄糖标准溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL放入6支试管中，向6支试管中分别加入纯化水使每支试管中均有2.0 mL的溶剂，另取一试管加入2.0 mL纯化水做空白对照。加入1.0 mL 5％苯酚、5 mL浓硫酸，振荡摇匀后加塞沸水中放置20 min，取出后凉水冷却10 min［7］。在490 nm波长处测定吸光度，以吸光度（A）为纵坐标、葡萄糖浓度（C，μg/mL）为横坐标绘制标准曲线［8］，得到回归方程为A=0.055 9C-0.128 2（R2=0.985 1）。

1.3.2 猫爪草多糖得率的测定。

将猫爪草的块根洗净、干燥再粉碎，电子天平称取5 g，在85%乙醇中进行浸泡1 h以去除有色物质、油脂和其他小分子物质［9］，将浸泡好的猫爪草进行减压抽滤，收获滤渣。加入纯化水，用热水浸提法提取猫爪草多糖，再次进行减压抽滤后得滤液。在旋转蒸发仪中55 ℃真空下将滤液浓缩后得浓缩液，再用95%乙醇4倍体积沉淀24 h，吸取上层乙醇，将沉淀进行离心，弃上清液取沉淀，沉淀用纯化水溶解并转移至100 mL容量瓶中用纯化水定容至刻度处，精密量取1 mL置于10 mL容量瓶中再用纯化水稀释至刻度线，得到猫爪草的多糖提取液。

取猫爪草多糖提取液2.0 mL于试管中，加入1 mL 5%苯酚和5 mL浓硫酸，振荡摇匀，沸水中放置20 min，取出后凉水冷却10 min，在490 nm处测定其吸光度。根据回归曲线方程可以得到猫爪草多糖质量浓度，按下式计算猫爪草多糖得率：

Y=C×V×nm×106×100%

式中：Y为猫爪草多糖得率（%）；C为猫爪草多糖质量浓度（μg/mL）；V为猫爪草溶液最终体积（mL）；n为稀释倍数；m为称取的猫爪草粉末的质量（g）。

1.3.3 单因素试验。

精确称取猫爪草粉末5 g，在不同提取时间（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）、不同提取温度（55、65、75、85、95 ℃）、不同液料比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1，mL∶g）条件下按“1.3.2”方法提取猫爪草多糖，考察各因素对猫爪草多糖得率的影响。

1.3.4 响应面试验设计。

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken中心组合的试验设计基本原理［10］，以猫爪草多糖得率为响应值，提取时间（A）、提取温度（B）、液料比（C）为自变量进行3因素3水平的响应面设计试验［11］，设计方案见表1。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取时间对猫爪草多糖得率的影响。

在液料比20∶1（mL∶g）、提取温度85 ℃的条件下，考察不同提取时间（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）对猫爪草多糖得率的影响。由图1可知，随着提取时间的延长，多糖得率总体呈现出先上升后下降的趋势。当时间为2.0 h时，猫爪草多糖得率达到最大值，为2.628%，再延长提取时间多糖得率下降。分析原因可能是刚开始提取时多糖持续从植物组织中释放出来，随着提取时间的延长，多糖成分分解；另外，杂质溶出的增多也会影响多糖溶出。因此，提取时间为2.0 h时，提取效果最佳。

2.1.2 提取温度对猫爪草多糖得率的影响。

在液料比20∶1、提取时间2.0 h的条件下，考察不同提取温度（55、65、75、85、95 ℃）对猫爪草多糖得率的影响。由图2可知，当提取温度在55～85 ℃，多糖得率逐渐增加，当提取温度达到85 ℃时，猫爪草多糖得率达到最大值，为2.621%；当提取温度大于85 ℃，多糖得率开始下降，这有可能是提取温度比较高，破坏了已经溶出的多糖。因此，在提取温度为85 ℃时，提取效果最佳。

2.1.3 液料比对猫爪草多糖得率的影响。

在提取时间2.0 h、提取温度85 ℃的条件下，考察不同液料比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1）对猫爪草多糖得率的影响。由图3可知，当液料比达40∶1时，多糖得率达到最大值，为1.622%，再增加提取液用量，多糖得率持续降低。可能因为当提取的溶液过少时，多糖的溶出就会受到限制，当增大提取的溶液量时，多糖的溶出量也随之增加，而当提取溶液过多时，其他杂质的溶出影响猫爪草多糖的溶出。因此，在液料比为40∶1时，提取效果最佳。

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面优化试验设计。

根据单因素试验结果，将提取时间（A）、提取温度（B）、液料比（C）3个因素设为自变量，猫爪草多糖得率（Y）设为因变量，用Box-Behnken组合设计法进行3因素3水平的响应面优化试验，试验设计与结果见表2。

运用Design Expert 10.0.1软件对响应面试验数据进行拟合，得到回归方程为

Y=2.99+0.13A-0.37B-0.25C-0.29AB+0.18AC+0.19BC-0.29A2-0.75B2-0.61C2。

多项式模型方程拟合可靠性由决定系数（R2）表达，R2越接近于1，拟合度越好。该模型的R2为0.944 3，模型拟合良好。在回归方程方差分析中，P的差值系數是用来检验回归模型系数的显著性，P值越小，模型的系数越显著［12］。由表3可知，模型P=0.001 3<0.01，表明该模型极为显著。失拟项P=0.226 2>0.05，模型选取是合理的，对试验结果的影响不显著。B、B2、C2的P值均小于0.01，表明对猫爪草多糖得率表现出极显著影响；C、AB、A2的P值均小于0.05，表明对猫爪草多糖得率表现出显著影响；A、AC、BC的P值均大于0.05，说明对猫爪草多糖的影响不显著。F值越大对猫爪草多糖得率的影响越大，该模型中各因素影响程度依次为提取温度（B）>液料比（C）>提取时间（A）。

响应面图和等高线图可以反映各因素间的交互作用对猫爪草多糖得率的影响。响应面图越陡越倾斜表示该因素的交互作用对猫爪草多糖的得率影响越显著，等高线越密集越接近椭圆形表示该因素的交互作用对猫爪草多糖的得率影响越显著［13］。

由图4可知，提取温度曲面的弯曲程度远远大于提取时间的弯曲程度，提取温度的曲面比较陡峭，说明提取温度对猫爪草多糖得率影响更大。确定两因素最佳水平参数范围为提取时间1.9～2.3 h、提取温度80～85 ℃，在此范围猫爪草多糖得率最高。等高线为椭圆形，说明提取时间与提取温度的交互作用显著。

由图5可知，提取时间曲面的弯曲程度比液料比曲面的弯曲程度小，液料比的曲面更陡峭，说明液料比对猫爪草多糖得率的影响更大。确定两因素最佳水平参数范围为提取时间1.9～2.3 h、液料比35∶1～40∶1，在此范围猫爪草多糖得率最高。等高线为椭圆形，说明提取时间与液料比的交互作用显著。

由图6可知，提取温度曲面的弯曲程度与液料比曲面的弯曲程度大致相同，说明这2个因素对猫爪草多糖得率的影响程度相差不大。确定两因素最佳水平参数范围为提取温度80～85 ℃、液料比35∶1～40∶1，在此范围内猫爪草多糖得率最高。等高线为椭圆形，说明提取温度与液料比的交互作用显著。

2.2.2 最佳工艺参数预测和验证试验。

经Design Expert 10.0.1拟合后得猫爪草多糖热浸提法最佳提取工艺为提取时间2.16 h、提取温度81.66 ℃、液料比37.90∶1，在此条件下，猫爪草多糖得率的理论值为3.094%。为了充分验证响应面法的可靠性和试验可行性，采用上述方法得到的最优提取工艺以及参数数据来进行验证试验，同时考虑到试验实际操作的安全可行性可操作性和简便性，确定猫爪草多糖的提取条件为提取时间2.16 h、提取温度82 ℃、液料比为38∶1，在此条件下进行3组平行试验，得到的猫爪草多糖实际得率分别为3.159%、3.145%、3.177%，平均值为3.160%，与理论值（3.094%）相差了0.07百分点，非常接近，这表明响应面法对猫爪草多糖热浸提提取工艺的优化可行可靠，具有实际应用价值。

3 结论

该试验以猫爪草为原料，采用热水浸提法提取猫爪草多糖。选取提取时间、提取温度、液料比进行3因素5水平的单因素试验。在单因素试验的基础上，以提取时间、提取温度、液料比为考察因素，以猫爪草多糖得率为评价指标，采用响应面法优化了猫爪草多糖的热水浸提提取工艺。确定最佳提取工艺为提取时间2.16 h、提取温度82 ℃、液料比38∶1（mL∶g），在此条件下，猫爪草多糖得率为3.160%，与理论值（3.094%）相差0.07百分点。该试验对猫爪草多糖成分提取工艺的优化为猫爪草多糖的药理作用研究和进一步开发应用提供理论依据。

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