基于GC-IMS结合化学计量法分析烧烤过程中温度对牦牛肉风味物质的影响

张 浩，易宇文，朱开宪，邓 静,*，胡金祥，刘 阳，乔明锋，白 婷

（1.四川旅游学院烹饪学院，四川 成都 610100；2.四川旅游学院 烹饪科学四川省高等学校重点实验室，四川 成都 610100；3.肉类加工四川省重点实验室，四川 成都 610106）

西藏是我国牦牛主要养殖省份之一，当雄县位于西藏自治区中部，属于高原大陆性气候，平均海拔4 200 m，拥有大片优质高原草场。当雄牦牛是当地特有牦牛品种[1]，高海拔、草饲、散养养殖环境使当雄牦牛肉具有色泽深红、质地较硬、蛋白质含量高的特点[2]，由于生长周期长，其肉质更有嚼劲，适合烧烤加工。牛肉中的糖类化合物包括糖原、葡萄糖、麦芽糖和核糖等，这些物质是牛肉受热发生美拉德反应的主要底物。烧烤作为最原始的烹饪方法，其烹饪过程中蛋白质分解产生游离氨基酸并与糖发生美拉德反应，从而产生风味物质[3]，这些风味物质是消费者喜爱烧烤的原因。消费者追求烧烤带来的香味和色泽，同时烧烤的高温会导致人体有害物质的产生[4]，因此，寻找满足美味与食品安全的适当烧烤温度十分重要。

目前国内外的研究大多集中在美拉德反应的条件和底物方面。例如，刘森轩[5]基于牛肉酶解和定向美拉德反应制备烤牛肉风味物质；Bai Shuang等[6]研究认为炒制时间是臊子香气化合物变化的主要因素；张杰等[7]研究加热温度影响牦牛肉肌原纤维蛋白与葡萄糖或果糖美拉德反应挥发性成分；刘雅娜等[8]研究认为180 ℃烤制羊肉风味最佳；徐永霞等[9]基于气相色谱-离子迁移谱（gas chromatography-ion mobility spectroscopy，GC-IMS）技术和化学计量学分析海鲈鱼肉蒸制过程中风味物质的变化；刘俊霞等[10]使用GC-IMS结合化学计量学分析大鲵肉冷藏期间挥发性成分。然而，关于牦牛肉烧烤过程中温度变化对风味物质的影响鲜见报道。

GC-IMS是一种新兴检测技术，结合气相色谱和离子迁移谱技术，可以对化合物进行可视化分析，其灵敏度高、响应快、无需预处理、稳定性好，能检测出小分子、低含量化合物[11]；感官评价是食品风味鉴别中最常见、简单的方法；利用相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）、化合物感官阈值分析风味化合物；融合分析可以从风味、色泽、气味上进行综合比较分析。

本研究以西藏当雄牦牛腿肉为对象，分别使用60、120、180、240、300 ℃万能蒸烤箱烧烤模式，采用GC-IMS结合感官评价、ROAV、偏最小二乘判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）、主成分分析（principal component analysis，PCA），解析烧烤过程中化合物变化及风味变化特征，旨在为风味机理形成研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

当雄牦牛肉后腿肉（半膜肌），产自当雄县，海拔4 300 m，草饲、散养，3 龄公牛，屠宰后经48 h排酸，－195.8 ℃液氮冷冻包装，空运到实验室，解冻到常温25 ℃。

正酮（C4～C9，色谱纯）国药集团化学试剂（北京）有限公司。

1.2 仪器与设备

Flavour Spec®GC-IMS仪 德国G.S.A公司；FOX4000电子鼻 法国Alpha MOS公司；CMP61G型万能蒸烤箱 德国RATIONAL公司；S20 mL顶空瓶 北京谱朋科技有限公司；BT423S型电子天平 德国赛多利斯公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

将解冻至常温25 ℃的半膜肌剔除筋膜和脂肪，分割成3 cm×4 cm×4 cm长方块，均匀撒少量食盐（便于化合物挥发），腌制15 min后，编号B～F组分别放入60、120、180、240、300 ℃的万能蒸烤箱，使用烧烤模式烤制7 min；出炉后立即检测牛肉外表温度、中心温度、拍照记录、嗅闻气味、称质量，完成感官评价；再取一块生肉作为参照组样品（A组）。烤制时间、温度、牛肉大小、质量是根据前期多次预实验结果确定。

1.3.2 感官评价

由5 位烹饪行业专家、5 位接受过食品感官评价课程培训的西餐专业同学组成评定小组，参考GB/T 22210—2008《肉与肉制品感官评定规范标准》共同制定评价标准（表1），然后在专业品评实验室开展感官评价。

表1 烧烤牦牛肉感官评分标准Table 1 Criteria for sensory quality of roasted yak meat

1.3.3 失水率测定

按式（1）计算失水率：

式中：m1为烤制后样品质量/g；m2为烤制后样品质量/g。

1.3.4 GC-IMS分析

参考师希雄等[12]的研究方法，将6 个样品剁细后，分别精确称量4.0 g，置于20 mL顶空瓶（IMS专用瓶）中，加装盖子、垫圈、旋紧瓶盖，编号待检；每个样品平行3 次。

进样条件：设置孵育温度60 ℃，孵育15 min；进样针温度65 ℃，顶空自动进样500 μL，转速500 r/min。

分析条件：使用MXT-5金属毛细管气相色谱柱（15 m×0.53 mm，1 μm），色谱柱温度60 ℃。载气为N2（纯度≥99.999%）。载气流速程序：初始流速2 mL/min，保持2 min，18 min内流速匀速升至100 mL/min，保持100 mL/min至30 min；漂移气流速保持150 mL/min；IMS温度45 ℃；记录挥发性化合物的保留指数（retention index，RI），将RI和漂移时间与GC×IMS库中信息进行对比定性。

数据分析：利用Flavor Spec风味分析仪配备的分析插件进行风味物质图谱分析，使用GC×IMS Library Search软件内置的NIST数据库和IMS数据库对风味物质进行定性分析。

1.3.5 ROAV计算

ROAV是一种结合阈值判定化合物重要性的方法，其原理及计算方法参考文献[13-14]，如式（2）所示：

式中：Cstan为最大化合物相对含量/%；Tstan为最大化合物阈值/（μg/kg）；Ci为某种化合物相对含量/%；Ti为某种挥发性化合物阈值/（μg/kg）。

1.4 数据处理与分析

2 结果与分析

2.1 不同温度条件烧烤牦牛肉感官评价结果

感官评价是食品检测最简单、便捷的方法，由表2、3可知，除去对照组A样品生肉，其余5 个样品经过7 min烧烤后，表面温度和中心温度均呈现较大变化，样品失水率为21%～46%，颜色差异明显。于亚辉等[15]研究认为温度140 ℃以上或反应时间过长时，发生焦糖化反应，糖分子裂解产生醛类、酮类物质的同时脱水形成焦糖色，使产品具有特殊的色泽与风味。温度和时间是影响美拉德反应褐变的关键，本研究在180 ℃出现明显褐变，且大量汁水渗出，这是由于香味前体物质、水溶性蛋白质和脂肪溶解导致。王吉等[16]研究认为肉类特殊风味很大程度取决于脂质加热后产生的挥发性物质，本实验在烧烤温度240 ℃获得脂质降解产生的牛肉香味，且样品中渗出大量带有油脂的透明汁水。以上结果表明，烧烤过程中受到样品质量、水分含量、时间和温度多重因素影响，对于短时间内必须完成的烧烤过程，可以通过调整烧烤温度控制烧烤的质量。感官评价结果表明：E＞F＞D＞C＞B＞A，表明烤制时间7 min时，最优烧烤温度为240 ℃。

表2 不同烧烤温度对牦牛肉失水率的影响Table 2 Effects of different roasting temperatures on water loss rate of yak meat

表3 不同烧烤温度下牦牛肉感官评价结果Table 3 Sensory evaluation results of roasted yak meat

2.2 GC-IMS分析结果

2.2.1 不同温度烧烤过程挥发性物质差异

GC-IMS 二维图谱中红色垂直线为反应离子峰（reaction ion peak，RIP），RIP两侧的每个点代表一种化合物，红色代表该化合物含量较高，蓝色代表含量较低[17-18]。如图1所示，明显可见不同烧烤温度下样品RIP强度差异较大，且随温度升高化合物种类先增加后逐步减少，表明不同温度下烧烤过程产生的化合物变化差异较大。化合物漂移时间在1.0～8.0 ms完成，保留时间在100～1 500 s完成；样品A在漂移1.5 ms完成，且对应颜色点较少，颜色较浅，说明化合物含量不高；与样品A相比，样品C、D、E化合物种类和含量均增加明显，样品F则明显大幅减少，保留时间也缩短至1 300 s左右。总的来看，样品A化合物含量较低，样品B、C、D化合物含量呈明显逐步增加趋势，样品F含量大幅减少。

图1 不同温度烧烤牦牛肉GC-IMS二维图谱Fig.1 Two-dimensional GC-IMS maps of yak meat roasted at different temperatures

为进一步了解挥发性化合物在牦牛肉烧烤过程中的变化趋势及差异性，采用仪器自带的Gallery Plot插件生成可视化指纹图谱。结果如图2所示，每一列代表化合物在不同样品中的相对含量，红色越深代表离子流信号强度大，面积越大代表浓度越高[19]，反之则小。按照化合物变化趋势划分为6 个区域进行分析。

图2 烧烤过程中牦牛肉挥发性化合物指纹图谱Fig.2 Fingerprint of volatile compounds in roasted yak meat

一区中，样品A、B、C、D、E中化合物含量呈逐渐升高趋势，在样品F（烧烤温度300 ℃）中化合物急剧下降。表明烧烤温度在180～240 ℃区间化合物含量逐渐达到最高，而温度达到300 ℃时反而急剧减少，其中，1-戊烯-3-醇、月桂烯、苯乙酮、4-己烯-1-醇、正戊醇含量变化较大。有研究表明醇类、醚类和烃类共同构成牛肉风味[20]，这一区域多种醇类化合物能赋予牦牛肉芳香和果香味。二区中，样品化合物含量随温度升高而升高，当温度为240 ℃，样品E化合物浓度最高，特别是乳酸丁酯和乙酸乙酯。这两种脂类在样品A中含量均较少，随温度不断升高而增大，烧烤后牦牛肉具有果香味和朗姆酒甜香回味可能与此有关。三区中，样品A、B、C化合物含量均较低，而样品D、E、F则较高，表明当温度在180～300 ℃时化合物含量逐步增大，变化较大的为乙酸丙酮、3-甲硫基丙醛（D）、3-甲基-2-丁烯醛、2-丁酮（D）、2,4,6-三甲基吡啶、乙酸甲酯、丁位己内酯、丙位辛内酯，大多是羰基化合物（源于糖类或油脂氧化后产生的醛类或酮类物质[21]）也是美拉德反应重要部分。

四区中，样品A、B化合物含量较低，而样品C、D、E化合物含量达到最高，样品F（烧烤温度300 ℃）未检测到这些物质或含量极低，主要为反-2,4-庚二烯醛、α-水芹烯、正丁醇（D）、2-甲基吡嗪。

五区中，样品E（240 ℃）化合物含量明显高于其他样品，样品F（烧烤温度300 ℃）急剧减少，主要为2-乙基-6-甲基吡嗪、正己酸乙酯、吡啶、香芹酮、2-甲氧基-4-甲基苯酚、6-乙基四氢-2H-吡喃-2-酮、丙位庚内酯、5-壬酮、对二甲苯、2-甲基-3-羟基-4-吡喃酮、苯酸甲酯、1-戊烯-3-酮、庚酸甲酯、2-甲基-1-戊醇、水杨酸乙酯、(Z)-4-癸烯醛、2-糠酸甲酯、γ-丁内酯、3-甲硫基丙醇、糠醛。氨基化合物（游离氨基酸、肽类等）发生反应，产生醛、酮、醇、呋喃、吡啶、吡嗪、噻唑、噻吩、咪唑及含氮或硫杂环化合物[22]，这一区域多为酮类、杂环类等对肉类风味影响较大的化合物。酚类物质主要呈现焦香、烟熏味，其阈值较低，对风味贡献较大[22]，实验中检测出2-甲氧基-4-甲基苯酚（愈创木酚），呈烟熏风味，说明当烧烤温度达到240 ℃时，样品E烧烤特殊的烟熏风味最强。六区中，样品A、B、C、D、E化合物含量均较低，而样品F（烧烤温度300 ℃）中这一区域化合物含量明显增加，主要为二乙二醇二甲醚、5-甲基呋喃醛、环戊酮、3-甲硫基丙酸乙酯、异丁醛。

综上，当烧烤温度到达240 ℃时，样品E化合物含量最高，且烧烤特有的烟熏风味最强，其次是180 ℃时（样品D），其化合物含量较高，但是当温度达到300 ℃时（样品F），化合物含量急剧减少。挥发性化合物含量并不能完全解释肉类的风味，肉类风味还与其风味阈值有关[23]，需要进一步进行ROAV分析。

2.2.2 挥发性化合物GC-IMS定性分析

如表4所示，烧烤过程中牦牛肉挥发性化合物共检测出82 种，包括醛类15 种、醇类12 种、脂类24 种、酮类14 种、杂环类7 种、烯烃类3 种、其他类化合物7 种；其中，3-甲硫基丙醛、正丁醇、2-丁酮为二聚体。使用归一法计算GC-IMS鉴定出的化合物的相对含量，如图3所示，烧烤牦牛肉中醛类相对含量14.2%～20.6%、醇类相对含量9.9%～12.1%、脂类相对含量22.1%～27.2%、酮类相对含量22.19%～30.3%、杂环类相对含量9%～11.8%、烯烃类相对含量4.3%～6.4%、其他类相对含量3.5%～5%。对肉类香味影响较大的酮类化合物含量随温度升高而增加，到一定温度后随之减少，这可能是受到脂肪氧化降解的影响；醇类与脂肪酸发生酯化形成酯类物质[24]，这可能是烧烤牦牛肉脂类种类较多和相对含量较大的主要原因；杂环类化合物相对含量较低，对肉类风味影响较小，也随烧烤温度明显变化。以上结果表明，烧烤温度变化对化合物相对含量影响较大，且十分复杂。

图3 烧烤牦牛肉化合物相对含量变化图Fig.3 Change in relative contents of volatile compounds in roasted yak meat

表4 烧烤牦牛肉鉴定出的挥发性化合物Table 4 Volatile compounds identified from roasted yak meat

2.2.3 PLS-DA结果

PLS-DA是有监督模式统计分析方法，将数据进行降维，实现复杂数据可视化及判别分析和预测[27]。如图4所示，以挥发性化合物相对含量为自变量（X），ROAV为因变量（Y），随机改变分类变量的排列顺序建立相应的模型，R2X=0.691，R2Y=0.994，Q2=0.975，当R2和Q2在0.5～1.0之间时，说明模型具有较好的解释和预测能力[28]，可以用于区分化合物差异，再进行置换检验，R2=（0.0，0.427），Q2=（0.0，－0.291），共2 组模型进行拟合验证，R2均位于X轴上方，Q2为负数，说明该模型可靠，不存在过拟合现象，模型相关性较好[29]。

图4 烧烤牦牛肉PLS-DA得分图（A）和验证图（B）Fig.4 PLS-DA score plot (A) and permutation test (B) of roasted yak meat

经PLS-DA模型分析得到变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值，再计算VIP＞1的化合物ROAV[30]，当化合物ROAV＞1时，其对样品风味有贡献，定义为影响风味的关键化合物[31]。如图5和表5所示，烧烤过程中牦牛肉风味关键化合物为乳酸乙酯、2-甲氧基-4-甲基苯酚、2-乙酰基-1-吡咯啉、5-壬酮、水杨酸乙酯、1-丙醇、(E,E)-2,4-庚二烯醛、1-戊烯-3-酮、(E)-2-庚烯醛、乙酸芳樟酯、正丁醇（D）、3-甲硫基丙醛（M）、2-乙基-6-甲基吡嗪、4-己烯-1-醇、(Z)-4-癸烯醛、反-2,4-庚二烯醛、苯乙醛、异丁酸乙酯等，共计18 种；其中，3-甲硫基丙醛（M）、2-乙酰基-1-吡咯啉ROAV＞10 000，说明在烧烤过程中对风味变化影响最大。

图5 烧烤牦牛肉中挥发性化合物的VIP值Fig.5 VIP values of volatile compounds in roasted yak meat

表5 烧烤牦牛肉中关键风味化合物的ROAVTable 5 ROAVs of key flavor compounds in roasted yak meat

2.2.4 烧烤牦牛肉关键化合物PCA结果

由图6可知，PC1贡献率为46.66%，PC2贡献率为34.79%，两者累计贡献率大于80%，可以代表化合物大部分信息[32]。PC双标图中样品E最靠近X轴，其次是样品B、C、D，样品F远离X轴，说明其风味区别于其他样品；对照组样品A为生肉，与烧烤后的牦牛肉相比表现出较大差异。与样品B靠近的乳酸乙酯呈浓郁的酒味，1-戊烯-3-酮呈蘑菇和金属气味，2-乙酰基-1-吡咯啉呈爆米花香，这些呈香物质与其他呈香物质混合可能会产生令人不愉快的气味。样品C、D相关的2-乙基-6-甲基吡嗪和2-甲氧基-4-甲基苯酚赋予样品坚果、烘焙的甜香气和烟熏风味、芳香味；与样品E相关的(E)-2-庚烯醛呈脂肪香气、正丁醇（D）呈酒精芳香味、反-2,4-庚二烯醛、乙酸芳樟酯赋予样品令人愉快的花香和果香；与样品F相关的3-甲硫基丙醛（M）赋予样品洋葱、肉香味；1-丙醇带有酒香气；异丁酸乙酯赋予果香。

图6 烧烤牦牛肉关键化合物PCA双标图Fig.6 PCA biplots of key flavor compounds in roasted yak meat

结合感官评价，样品E风味最佳，具有烤肉香味、脂肪香气和花果气味；样品C、D次之，具有坚果、烤面包的甜香气味和烟熏风味；样品A位于第3象限风味较差。

3 结论

采用感官评价、GC-IMS结合ROAV、PLS-DA、PCA评价不同温度烧烤牦牛肉中气味物质的变化。感官评分依次为样品E＞F＞D＞C＞B＞A，烤制时间为7 min时，最优烧烤温度为240 ℃。GC-IMS共鉴定出82 种挥发性化合物，包括醛类15 种、醇类12 种、脂类24 种、酮类14 种、杂环类7 种、烯烃类3 种、其他类化合物7 种；当烧烤温度到达240 ℃时，样品E化合物含量最高，且烧烤特有的烟熏风味含量最大；其次是样品D、C，当温度到达300 ℃时样品F化合物含量急剧降低。ROAV分析表明，乳酸乙酯、2-甲氧基-4-甲基苯酚、2-乙酰基-1-吡咯啉、5-壬酮、水杨酸乙酯、1-丙醇、(E,E)-2,4-庚二烯醛、1-戊烯-3-酮、(E)-2-庚烯醛、乙酸芳樟酯、正丁醇（D）、3-甲硫基丙醛（M）、2-乙基-6-甲基吡嗪、4-己烯-1-醇、(Z)-4-癸烯醛、反-2,4-庚二烯醛、苯乙醛、异丁酸乙酯这18 种化合物是烧烤牦牛肉关键风味化合物。实验结果表明，样品E风味最佳，呈烤肉香味、脂肪香气和花果气味；样品C、D次之，呈坚果、烤面包的甜香气味和烟熏风味。样品B虽然靠近X轴，气味浓郁，但风味较差。研究结果对后续风味形成机理提供一定理论参考。