“金花”菌的鉴定及接种发酵六堡茶的品质变化

吴新惠，杜金杰，刘晓纯，廖楷滨，覃玉娜，张瑜容，张灵枝，龙志荣，邱瑞瑾

（1.华南农业大学园艺学院，广东 广州 510642；2.梧州市茶产业发展服务中心，广西 梧州 543000；3.梧州市六堡茶研究院，广西 梧州 543003）

六堡茶属黑茶，是中国历史名茶、国家地理标志保护产品，素以“红、浓、陈、醇”四绝著称，具有降血脂、降血糖、抗氧化、抗菌、保护肝脏等保健功效[1-2]。微生物对六堡茶品质形成具有重要影响。但目前，传统六堡茶生产仍存在发酵菌种难以控制、渥堆发酵及陈化时间长、品质不稳定等问题。因此，亟须对传统六堡茶发酵工艺进行优化改进，控制参与发酵的微生物种类、稳定六堡茶产品品质，使六堡茶产品生产标准化、工业化。

“金花”菌多为曲霉属（Aspergillus）、散囊菌属（Eurotium）和青霉属（Penicillium）[3]，能在茶叶表面产生金黄色闭囊壳，其质量和数量是衡量茯砖茶品质的重要指标[4-5]。前人研究表明，六堡茶中存在多种“金花”菌[6-8]，能够分泌淀粉酶和氧化酶，对六堡茶的香气、滋味等物质转化发挥一定作用。“金花”的数量是判定六堡茶品质的依据之一，也是六堡茶特色保健功效的基础[9]。六堡茶的“金花”在陈化过程中随机发生，陈化环境中的温、湿度条件对六堡茶发花影响很大，而六堡茶制作工艺中没有专门的发花工序。为提高“金花”数量，也有人对六堡茶的“发花”工艺进行优化[10]，但仍然难以实现标准化生产“金花”六堡茶。近几年也有不少学者对六堡茶“金花”菌进行相关研究。毛彦等[11]从广西银泰六堡茶厂中分离得到一株雪黄散囊菌（E.niveoglaucum）。徐书泽[12]利用高通量测序技术从梧州茶厂成品茶中分离到一株阿姆斯特丹散囊菌（E.amstelodami），欧惠算[8]在梧州中茶茶厂刚压好的茶中也分离到阿姆斯特丹散囊菌，发现该菌在茶叶液态发酵过程中能降低茶多酚、黄酮类、氨基酸以及可溶性糖的含量，使茶褐素含量总体增加；陈然等[7]对多家梧州六堡茶龙头企业生产的六堡茶的真菌进行分析，发现优势菌种为散囊菌属，不同厂家真菌种类各有差异，都检测出不同含量的“金花”菌，主要是冠突散囊菌（E.cristatum）和谢瓦氏散囊菌（E.chevalieri）；苏赞等[13]从广西梧州六堡茶中分离到两株谢瓦氏曲霉（A.chevalieri），能分泌一定量的果胶酶、纤维素酶和淀粉酶。在六堡茶渥堆过程中也有“金花”菌参与，黄紫衡等[14]从不同渥堆阶段的六堡茶中分离到冠突曲霉（A.cristatus），这说明六堡茶“金花”菌贯穿发酵过程，但对于渥堆过程“金花”菌的相关研究有限，“金花”菌的发酵机理在六堡茶中鲜有报道，利用“金花”菌固态发酵六堡毛茶的相关研究鲜见报道。

本研究根据分离培养特征、光学显微镜结构特征和内源转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）序列比对分析，结合系统发育分析等多种鉴定手段，对渥堆过程六堡茶中的“金花”菌进行分离鉴定。将分离到的“金花”菌接种至灭菌六堡毛茶中进行固态发酵，研究不同“金花”菌对六堡茶滋味品质的影响，探索不同“金花”菌之间的差异，筛选优良菌株，以期为六堡茶“金花”菌的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

发酵茶样：苍梧县群体种六堡毛茶；“金花”菌：从广西梧州中茶茶厂2020年9月渥堆茶样中分离得到。

没食子酸（gallic acid，GA）、儿茶素（catechin，C）、表儿茶素（epicatechin，EC）、表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）、表儿茶素没食子酸酯（epicatechin-3-gallate，ECG）、表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、没食子儿茶素（gallocatechin，GC）、儿茶素没食子酸酯（catechin gallate，CG）、没食子儿茶素没食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）和咖啡因 远野生物（上海）有限公司；真菌DNA提取试剂盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基、查氏琼脂（Czapek-Dox agar，CA）培养基 广东环凯微生物科技有限公司；本研究中使用的所有化学品和试剂均为分析试剂级；超纯水由Milli-Q水净化系统制备。

1.2 仪器与设备

HSG-GIIC-4电热恒温水浴锅 上海仪表供销公司；WFJ7200可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；PL303电子天平 瑞士梅特勒-托利多公司；TD-5Z低速离心机 四川蜀科仪器有限公司；SW-CJ-2F双人双面超净工作台 苏州净化设备有限公司；GXZ-250A 恒温光照培养箱 宁波江南仪器厂；ALANCE E295高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪 美国Waters公司；C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）美国旭日公司；NRB290JD-XN立式冰箱 松下家电（中国）有限公司；Milli-Q-B超纯水系统 美国Millipoe公司；血球计数板上海求精生化试剂仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分离鉴定

参照文献[5]的方法，真菌采用引物ITS1和ITS4进行分析，测定序列。将得到的序列在NCBI上用BLAST软件进行同源序列比对，选择相似性大于97%的序列作为菌种鉴定参考，用MEGA-X软件构建参考菌与鉴定菌种的系统发育树。

1.3.2 菌悬液的制备

将4 株菌接种于PDA培养基中，置于培养箱中28 ℃培养7 d。用无菌生理盐水洗脱孢子，转移至锥形瓶（带灭菌玻璃珠）充分振荡摇匀（1 h），采用血球计数板对孢子计数并调节孢子浓度约为1×107CFU/mL，保存备用。

1.3.3 接种菌悬液

称取100 g六堡毛茶置于500 mL三角瓶中，121 ℃高压灭菌20 min，冷却备用。按照1×107CFU/mL的接种浓度接种菌悬液至灭菌毛茶培养，同时调整发酵含水量（渥堆潮水量）为25%，于28 ℃、相对湿度80%的培养箱中发酵，期间每7 d摇瓶一次，使茶样发酵均匀，28 d后取出用微波固样后保存待用；以不接种只加无菌纯水发酵的灭菌毛茶作为对照（CK）。每组样品均进行3 次重复发酵。

1.3.4 主要化学成分的检测

水浸出物总含量测定参照GB/T 8305—2013《茶 水浸出物测定》[15]；游离氨基酸总含量测定参照GB/T 8314—2013《茶 游离氨基酸总量的测定》[16]；黄酮类化合物总含量测定采用三氯化铝比色法；可溶性糖总含量测定采用蒽酮-硫酸比色法；茶黄素、茶红素、茶褐素总含量测定采用文献[17]所述方法；咖啡碱总含量测定参照GB/T 8312—2013《茶 咖啡碱测定》[18]；茶多酚含量、儿茶素类组分、GA含量测定参照GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》[19]。

1.3.5 HPLC分析

样品制备：称取0.2 g茶粉加入5 mL在70 ℃水浴锅中预热过的体积分数70%甲醇溶液，浸提10 min后3 500 r/min离心10 min，收集上清液至10 mL定容瓶。茶渣重复提取一次，合并两次上清液，用体积分数70%甲醇溶液定容，摇匀，0.45 μm膜过滤后上机。

检测条件：流动相A：体积分数90%甲醇（平衡柱子）；流动相B：体积分数5%甲醇溶液；流动相C：体积分数0.05%磷酸溶液；流动相D：乙腈；流速1 mL/min；波长280 nm；后运行时间5 min；柱温25 ℃；进样量10 μL。洗脱条件：A：0～3 min、95%～90%，3～6 min、90%，6～8 min、90%～80%；C：0～30 min、93.5%～84.0%，30～34 min、84.0%～80.0%，34～39 min、80.0%～80.0%，39～40 min、80.0%～93.5%，40～45 min、93.5%～93.5%；D：0～30 min，6.5%～16.0%，30～34 min、16.0%～20%，34～39 min、20%～20%，39～40 min、20.0%～6.5%，40～45 min、6.5%～6.5%。

1.3.6 感官审评

按照GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》中的黑茶（散茶）的审评方法，感官审评小组由5 位具有专业茶叶审评资格的小组成员（2 男3 女）组成，用专业的茶叶审评术语得出审评结果。

1.4 数据处理与分析

测定结果取3 次重复实验的平均值。采用Excel 2016软件处理数据，采用SPSS 24进行方差分析和差异显著性分析，采用GraphPad Prism 8进行作图，采用Origin 2021软件进行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 结果与分析

2.1 4 株“金花”菌的分离鉴定结果

2.1.1 “金花”菌的形态学特征

从渥堆六堡茶中分离纯化得到4 株“金花”菌，分别命名为LB-22、LB-32、LB-35、LB-55。采用三点法将4 株“金花”菌接种到CA培养基上生长7 d，如图1所示，LB-35在CA培养基上生长最快；LB-22菌落质地紧密，较平整，圆形绒状，整体呈金黄色泛绿，中间部位颜色较浅；菌落背面光滑，颜色同正面；LB-32质地密集，正面中心灰绿色，外围浅绿色，边沿浅杏色，圆形，背面光滑，有黄色闭囊壳；LB-35菌落质地紧密，圆形有脊，呈放射状，正面背面金色，边沿颜色较浅；LB-55菌落质地紧密，圆形，正面同背面，金黄色，中心颜色稍深，黄色闭囊壳丰富。根据形态学观察结合光学显微镜观察结果，初步将LB-22鉴定为青霉属，LB-32、LB-35和LB-55鉴定为曲霉属。

图1 菌株在CA培养基平板上正面（A）、反面（B）及其在光学显微镜下分生孢子形态（C）、菌丝形态（D）Fig.1 Fron (A) and back view (B) of strains cultured on CA medium plates;and morphology of conidial head (C) and mycelium (D) under light microscope

2.1.2 “金花”菌的分子生物学鉴定

将菌株测序所得序列与NCBI数据库进行比对，构建系统发育树，如图2所示。结合表1可知，菌株LB-22为芒果青霉（P.manginii）、LB-32为赤曲霉（A.ruber）、LB-35为间型曲霉（A.intermedius）、LB-55为阿姆斯特丹曲霉（A.amstelodami）。

表1 真菌的ITS序列分子鉴定结果Table 1 ITS molecular identification of fungi

图2 分离到的真菌与BLAST比对结果的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of fungal isolates based on BLAST results

2.2 4 株“金花”菌发酵对六堡茶感官品质的影响

从表2可知，4 株“金花”菌对六堡毛茶发酵均有很大影响，发酵28 d后，在外形、汤色、香气和滋味上都有明显改变。未加菌CK干茶外形乌褐油润，开汤后香气纯正、生晒味，汤色橙黄、清澈明亮，滋味浓强、苦涩，叶底绿褐，与毛茶感官品质接近，说明在无菌状态下仅有湿热作用，对六堡茶感官品质影响不大。4 株“金花”菌发酵的茶样中，LB-22和LB-35发酵六堡茶外形无金花，LB-32和LB-55发酵茶样表面布满金花，说明“金花”菌需要特定的发酵环境中才能产金黄色闭囊壳。4 种发酵茶样在香气方面差异显著，LB-22发酵茶样菌香带花香；LB-32发酵茶样木香；LB-35发酵茶样木质香带甜香、清花香；LB-55发酵茶样板栗香带甜花香。4 种发酵茶样的汤色都有显著改善，尤其是LB-32发酵茶样汤色红浓、清澈。在滋味上，LB-35发酵茶样滋味醇厚顺滑、带甜；LB-55发酵茶样醇滑带甜；LB-32醇和顺滑，有陈味；LB-22发酵茶样醇和，稍带收敛性，带腥味。叶底上，4 种发酵茶样均较柔软，色泽无明显差异。总体而言，接种LB-35的茶样香气更突出，滋味更醇厚。

表2 “金花”菌发酵茶叶感官审评结果Table 2 Results of sensory evaluation of tea fermented by“Golden Flower” fungi

2.3 4 株“金花”菌发酵六堡茶生化成分的变化

2.3.1 茶多酚、没食子酸及儿茶素的变化

茶多酚是茶叶中多酚类物质的总称[20]，在茶汤中呈苦涩味，有较强的刺激性，对茶叶的色、香、味都有很大影响[21]。从表3可知，与CK相比，在4 株“金花”菌作用下，茶多酚含量呈极显著下降趋势（P＜0.01），LB-22、LB-32、LB-35和LB-55发酵组分别降低了37.47%、47.98%、40.02%、23.04%，这与冉莉莎[22]、龚受基[23]等的研究结论一致。值得注意的是，对比CK，除茶黄素含量无显著性变化外，其余各发酵组茶褐素含量均极显著升高（P＜0.01），而茶红素含量均极显著降低（P＜0.01），这与单治国[24]、Wang Zihao[25]等研究结论一致。4 株“金花”菌发酵均能将茶多酚主要转化为茶褐素，尤其是LB-35发酵样，茶褐素质量分数达（13.14±0.13）%。

表3 4 株“金花”菌固态发酵对六堡茶化学成分的影响Table 3 Effect of solid state fermentation by four “Golden Flower”fungi on chemical composition of Liupao tea

GA属于茶多酚类物质，具有显著的抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌、抗突变等生理活性[26-27]。与CK相比，LB-22、LB-35和LB-55发酵组GA含量极显著降低（P＜0.01），LB-22、LB-35分别降低了89.26%、94.63%，LB-55发酵组几乎检测不到，LB-32组GA含量极显著升高（P＜0.01），达（8.39±0.05）mg/g，这与Ma Cunqiang等[28]的研究结果类似。

儿茶素是茶苦味的重要来源，是茶多酚中最重要的一种，占茶多酚总量的70%～80%，具有广泛的药理活性，是茶叶中重要的非挥发性成分[29]。与CK相比，LB-22、LB-32、LB-35和LB-55发酵组的酯型儿茶素含量均极显著下降（P＜0.01），其中EGCG含量分别降低了79.91%、86.04%、91.13%、92.84%，使得茶汤苦涩味转化为醇厚，这一结论与Wang Yali等[29]的研究相似，GCG含量分别降低了71.60%、84.45%、88.91%、92.80%，ECG含量分别降低了76.90%、83.01%、88.06%、87.75%；CG含量分别降低了40.07%、98.37%、96.74%、62.21%。而4 株“金花”菌发酵六堡茶的非酯型儿茶素中，除EC含量均下降外，GC、EGC、C含量的变化趋势各有不同。与CK相比，LB-32发酵六堡茶的GC含量上升了10.08%（P＜0.01），LB-22、LB-35、LB-55分别降低了46.46%（P＜0.01）、65.91%（P＜0.01）、13.45%（P＜0.01）；LB-22发酵六堡茶的EGC含量上升了72.59%（P＜0.01），LB-32、LB-35、LB-55分别降低了2.63%、70.26%（P＜0.01）、36.18%（P＜0.01）；LB-22和LB-55发酵六堡茶的C含量较CK组分别上升了44.00%（P＜0.01）和51.56%（P＜0.01），LB-32和LB-35的C含量较CK组分别降低了23.33%和65.33%（P＜0.01）。4 株“金花”菌发酵六堡茶的总儿茶素均极显著降低（P＜0.01），分别降低了44.30%、68.00%、84.61%、73.31%。以上结果表明，虽然4 株“金花”菌发酵六堡茶各儿茶素类组分含量的变化趋势不同，但总儿茶素和酯型儿茶素的含量极显著下降（P＜0.01），减轻了六堡毛茶的苦涩味和刺激性。

2.3.2 水浸出物、游离氨基酸含量的变化

水浸出物是茶汤主要呈味物质的统称，水浸出物含量的高低可作为判断茶汤厚薄、浓强的标准，一定程度反映了六堡茶品质的优劣[24]。由表3可知，与未接菌CK相比，六堡毛茶经不同“金花”菌发酵28 d后，茶叶中水浸出物含量变化也各不相同，LB-22与LB-32发酵茶样水浸出物含量显著下降（P＜0.05），而LB-35和LB-55样含量显著上升（P＜0.05），接种LB-55发酵的六堡茶水浸出物质量分数达到39.77%，明显高于其他3 株“金花”菌发酵的六堡茶，结合感官审评结果（表2）可知，LB-55发酵的六堡茶茶汤滋味醇厚。

游离氨基酸是茶叶滋味与香气形成的重要前体物质。由表3可知，与CK相比，在4 株“金花”菌作用下，游离氨基酸含量呈极显著下降趋势（P＜0.01），下降幅度最大的是LB-32。造成氨基酸含量下降的原因可能是“金花”菌生长过程中利用氨基酸作为生长氮源，同时在酶促作用下产生脱氨作用和脱羧作用，将氨基酸转化为挥发性或非挥发性芳香物质[32]。

2.3.3 咖啡碱含量的变化

由表3可知，与CK相比，4 株“金花”菌发酵六堡茶的咖啡碱含量变化各异，LB-32和LB-55发酵六堡茶咖啡碱含量呈极显著增加趋势（P＜0.01），LB-55发酵茶样中咖啡碱含量达（53.74±0.06）mg/g，LB-22和LB-35发酵组呈下降趋势。据报道，咖啡碱在六堡茶成品茶中的含量一般为28.30～29.30 mg/kg[31]。研究表明，霉菌类可以提高后发酵过程中茶叶的咖啡碱含量[33]。

2.3.4 黄酮和可溶性糖含量的变化

茶叶中的黄酮类化合物主要是黄酮醇及其苷类，是多酚类物质的一部分，能溶于热水，对茶的色泽和滋味均有一定影响。由表3可知，与CK相比，在4 株“金花”菌作用下，总黄酮含量极显著下降（P＜0.01），但4 种发酵茶之间差异不显著。

可溶性糖具有甜味，对咖啡碱的苦涩味有一定的抑制和协调作用，可溶性糖含量越高茶叶滋味越甘醇。由表3可知，与CK相比，LB-22、LB-32和LB-35发酵组可溶性糖含量呈极显著下降趋势（P＜0.01），其原因可能是发酵菌种生长繁殖时需要大量的可溶性糖作为碳源和能量来源[34]，另外糖类物质在微生物发酵作用下，与儿茶素生成糖苷化儿茶素，也可能导致茶中可溶性糖含量降低[35]；LB-55发酵组可溶性糖含量呈极显著增加趋势（P＜0.01），结合感官审评结果（表2）可知，LB-55茶样在滋味审评中带甜味。

2.3.5 PCA

为探究“金花”菌对六堡茶主要化学品质的影响，基于19 种检测成分进行PCA 和层次聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）。如图3所示，4 株“金花”菌发酵六堡茶和CK差异显著。PCA将5 个处理组划分为2 组，组1包括CK组，组2包括LB-22、LB-32、LB-35、LB-55组，PC1和PC2分别解释总方差的49.53%和19.78%，CK与4 株“金花”菌发酵茶样相比，在PC1上被区分；LB-22和LB-32与LB-35和LB-55发酵样品在PC2上被区分，表明不同“金花”菌发酵对六堡茶品质成分影响各异。茶黄素、GCG、ECG、EGCG和总儿茶素分别是PC1的前5 位贡献物质，水浸出物、EGC、茶红素、黄酮和GA是PC2的前5 位贡献物质。此外，HCA表明这些化学成分也聚为两簇，茶褐素和水浸出物聚为一簇，其他17 种化合物聚为另一簇。

图3 4 株“金花”菌发酵六堡茶与CK茶样中19 种特定化学成分的PCA（A）和HCA（B）Fig.3 PCA plot (A) and HCA heatmap (B) of 19 specific chemical components in Liupao tea fermented by four “Golden Flower” fungi and control samples

3 结论

从广西六堡茶渥堆过程的茶样中分离出4 株“金花”菌，通过菌落形态、光学显微镜特征和分子生物学鉴定绘制系统发育树，4 株“金花”菌分别鉴定为LB-22P.manginii、LB-32A.ruber、LB-35A.intermedius和LB-55A.amstelodami。其中，A.ruber和A.amstelodami是六堡茶渥堆及陈化过程中曾报道过的“金花”菌[7-8]，而P.manginii和A.intermedius与以往所报道的六堡茶“金花”菌不同，曾出现于茯砖茶和普洱茶中，对茶叶品质成分转化有重要影响[28,35-36]，P.manginii为“金花”普洱茶中曾报道过的优势菌，Zhou Binxing等[37]通过对比贮藏过程中“金花”普洱茶和普洱茶的化学成分和真菌群落，发现P.manginii与可溶性糖含量呈极显著正相关（P＜0.01）。

为探索4 株“金花”菌固态发酵对六堡茶品质的影响，分别通过感官审评和HPLC法，分析测定了4 种“金花”菌发酵六堡茶中的感官品质及主要化学成分，包括水浸出物、可溶性糖、游离氨基酸、茶多酚、3 种茶色素、8 种儿茶素类物质、总黄酮类化合物、GA和咖啡碱含量。PCA和HCA揭示了4 株“金花”菌发酵与CK之间的差异。特别是通过PCA，LB-22、LB-32、LB-35和LB-55发酵六堡茶聚为一组，与CK表现出明显差异。六堡毛茶经过4 株“金花”菌发酵后，总黄酮、总游离氨基酸、茶多酚、茶红素、儿茶素类（EC、CG、C、EGCG、GCG、ECG）和总儿茶素含量极显著降低（P＜0.01），而茶褐素含量极显著升高（P＜0.01），结合感官审评结果，4 株“金花”菌发酵均能明显改善六堡茶品质，使毛茶的品质在相对较短的时间接近成品茶，即汤色由橙黄转为红浓、红棕，增加了陈香、木质香、菌花香，滋味由浓强苦涩转为醇厚顺滑。4 株“金花”菌发酵六堡茶感官品质各有不同，增添了六堡茶新的风味，特别是LB-35A.intermediu发酵的六堡茶滋味醇厚顺滑带甜，木质香带甜花香，汤色红棕明亮，可作为六堡茶发酵优势菌种应用于生产。本研究结果有助于六堡茶“金花”菌的开发和利用，可为六堡茶产业化研究、产品定向开发提供理论依据。