3 种Maillard 反应前体物质对稻草木质素腐解及腐殖质组成的影响

白成鑫 高嘉聪 曾檬 赵泓博 赵鑫 王帅 王楠

（1吉林农业科技学院 农学院，吉林 吉林 132101；2 吉林农业大学 农学院，长春 130118；第一作者：baichengxin123@126.com；*通信作者：wangnan664806@126.com）

稻草是水稻规模化生产的副产物，占农作物秸秆总产量的30%~40%[1]。稻草还田可改善土壤肥力，增加土壤孔隙，减少稻草因焚烧而引发的环境污染。在众多还田方式中，稻草腐解再还田被视作是理想的方式。一般情况下，在东北地区水稻收获后就已进入冬季，待春季转暖后，距离插秧前较短的温和期（3 月下旬至5 月中旬，4℃~15℃）是稻草腐解的关键时期，稻草本身木质素含量较高且不易腐解，微生物在较短的自然温和期往往不能完全腐解稻草。探索稻草腐解的促进因素对于北方稻草离田腐解技术研究尤为关键。

稻草中木质素含量约为4.83%。稻草中的木质素成分是自然界中含量仅次于纤维素和半纤维素的芳香族高分子聚合物，稻草腐解过程伴随着木质素的腐殖化，木质素腐殖化的结果是产生腐殖质（HS），但该过程往往既漫长又复杂，是稻草腐解成功与否的关键，在生产上寻求能催化稻草腐解进程的积极因素具有重要实践指导意义。Maillard 反应是Cat、Gly 和Glu 3 种前体物质在δ-MnO2催化下进行非生物缩合的腐殖化过程，通过在稻草腐解中额外添加，各物质通过氧化与亲核反应能够聚合形成类腐殖质[2]，促进稻草腐解。也就是说，3 种Maillard 反应前体物质通过各类反应能够促进稻草的腐殖化，其中，Glu 是微生物的直接供能物质，能够明显增加微生物活性，促进无机氮素固持、减少氮素流失，为菌丝体形成提供能量，促进芳香环的分解[3]；Cat 依据多酚理论易被氧化成醌类直接参与HS 的形成；Gly 水解产生低分子量有机酸能够为多酚形成提供基础材料，间接促进HS 的形成。WU 等[4]研究认为，在堆肥过程中，多酚、羧酸、氨基酸、还原糖和多糖5 种前体物质可通过木质素-蛋白质途径、多酚途径和Maillard 反应等机制促进HS 的形成[5]。张雪辰等[6]通过向牛粪、菌糠和鸡粪组成的共堆肥体系中添加含有激发自然界微生物快速繁殖营养因子（速效碳源、氮源和微量元素）的发酵激发剂，验证了其能有效促进堆肥有机碳矿化分解的结论。前体物质是调控堆肥HS 形成的关键[7]。本研究采用室内培养法，以稻草为基础材料，通过上述3 种Maillard 反应前体物质的外源加入，从腐殖质组成角度揭示各前体物质在稻草腐解过程中的贡献，为稻草高效腐解提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

稻草取自吉林农业科技学院北大地水稻试验田，经风干、粉碎过0.25 mm 孔径筛备用，其总有机碳、N、P2O5和K2O 含量分别为37.8%、1.93%、2.33%和0.76%。

微生物菌剂制备：称取天津环微生物科技有限公司出品的秸秆腐熟剂（有效活菌数≥200 亿cfu/g）1 g于100 mL 无菌水中，在28 ℃气浴振荡器中以120 r/min 的转数振荡提取2 h，静止沉降30 min 后以3 500 r/min 的转数离心15 min，收集上清液，其中活菌数≥1.8×108个/mL，主要包括木霉菌、芽孢杆菌、放线菌、假单胞菌、乳酸菌和酵母菌等。

1.2 试验设计

试验于2021 年5 月进行，采用室内培养法，准确称取12.0 g 稻草粉末于100 mL 三角瓶中，用一定浓度的（NH4）2SO4溶液调节稻草粉末含水量60%和C/N 比为25∶1。试验共设3 个处理，分别在装有稻草粉末的三角瓶中添加5 mL 0.12 mol/L 的邻苯二酚（Catechol）、葡萄糖（Glucose）和甘氨酸（Glycine），以添加等体积的蒸馏水为对照，分别用Cat、Glu、Gly 和CK 表示，每个处理在各培养时间下均重复3 次、设置3 个瓶，用无菌透气膜封口，将上述处理对应的三角瓶置于121 ℃条件下高压蒸汽灭菌20 min，待冷却至常温后，在无菌操作条件下接种10 mL 微生物菌剂，再次用无菌透气膜封口，启动28 ℃的恒温好氧培养，期间按恒重标准动态补水，使含水量始终稳定在60%，在培养0、45 和90 d时动态取样，取样后立即转入50 ℃鼓风干燥箱中风干来终止微生物反应，磨细过0.25 mm 孔径筛，备用。

1.3 测试指标及方法

在Kumada 方法上作修订进行腐殖质组成分析[8]。称取1.0 g 稻草粉末于100 mL 聚乙烯离心管中，加入30 mL 蒸馏水搅拌均匀，在70 ℃恒温水浴振荡器中提取1 h，离心（3 500 r/min，15 min），吸取上清液于50 mL容量瓶中，之后在含有残渣的离心管中继续加20 mL蒸馏水搅拌均匀，3 500 r/min 离心15 min，将此次上清液与前次合并，用蒸馏水定容，所获溶液即为水溶性物质（water soluble substance，WSS）；在此前的残渣中加入0.1 mol/L NaOH 和0.1 mol/L Na2P2O7的混合液，于3 500 r/min 离心15 min，按上述步骤对残渣进行二次提取，获得的上清溶液为可提取腐殖酸（humic-extracted acid，HE）；离心管中残渣用蒸馏水多次洗涤、离心，直至洗液近中性，将其转入50 ℃鼓风干燥箱中烘至质量恒定，该沉淀即为胡敏素（humin，Hu）。

吸取30 mL HE 溶液，用0.5 mol/L 的H2SO4将其pH 调至1.0~1.5，置于70 ℃水浴锅中保温1.5 h，静置过夜，出现絮状沉淀，次日将含有沉淀的溶液过滤于50 mL 容量瓶中并定容，此溶液为富里酸（fulvic acid，FA）；用稀酸淋洗滤纸上的沉淀，再用0.05 mol/L 温热的NaOH 将沉淀溶解于50 mL 容量瓶中，用蒸馏水定容，获得胡敏酸（Humic acid，HA）碱溶液，采用外加热-重铬酸钾氧化法测定总有机碳（TOC）含量及WSS、HE、HA 和Hu 组 分 的 有 机 碳 含 量（CWSS、CHE、CHA和CHu），差减法（CHE-CHA）计算FA 组分的碳含量（CFA）并由此计算胡富比（HA 组分有机碳含量与FA 组分有机碳含量之比，CHA/CFA）；采用北京普析通用仪器有限责任公司生产的TU-1901 型紫外可见分光光度计测定HE 碱溶液的400 nm 和600 nm 处的光密度（A400nm和A600nm），计算色调系数（△lgK=lgA400nm-lgA600nm）。

1.4 数据处理

采用Excel 2003 软件对数据进行整理并绘图，用SPSS 18.0（PASW Statistics 18）软件对数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 对稻草腐解进程总有机碳（TOC）含量的影响

由图1 可知，随着培养时间的延长，Cat、Glu、Gly和CK 的TOC 含量均呈降低趋势。与0 d 相比，培养90 d 后，Cat、Glu、Gly 和CK 处理下的TOC 含量分别降低了17.8%、22.9%、18.0%和13.3%。与CK 相比，添加Maillard 反应底物的3 个处理对TOC 矿化分解作用均有所促进，其中，Glu 的作用最为显著。

图1 添加Cat、Glu 和Gly 对稻草腐解进程TOC 含量的影响

2.2 对稻草腐解进程可提取腐殖酸碳（CHE）含量及HE碱溶液△logK 的影响

如图2 所示，在整个培养过程中，不同处理的CHE含量呈现不同的变化规律，Cat 处理的CHE含量随培养时间延长而逐渐升高，而Glu、Gly 处理和CK 的CHE则表现为先升高后下降。与0 d 相比，培养结束时（90 d），Cat、Glu、Gly 处 理 和CK 的CHE含 量 分 别 增 加 了475.4%、456.8%、397.5%和386.5%，Cat 处理CHE的增幅最大，其次为Glu 处理。

图2 添加Cat、Glu 和Gly 对稻草腐解进程CHE 含量的影响

如图3 所示，随着培养时间延长，各处理HE 碱溶液△lgK 均表现为渐趋降低趋势，其中添加Maillard 反应前体物质的3 个处理历经45 d 和90 d 的培养结果无显著差异，更有利于培养中后期HE 分子结构的稳定。与0 d 相比，培养结束时（90 d）Cat、Glu、Gly 处理和CK 的HE 碱溶液△lgK 分别降低10.0%、12.9%、30.2%和19.1%，降幅最大的是Gly 处理，即添加Gly 更有利于提升稻草腐解后HE 分子的复杂化。

图3 添加Cat、Glu 和Gly 对稻草腐解进程HE 碱溶液△lgK的影响

2.3 对稻草腐解进程胡敏酸碳（CHA）含量的影响

如图4 所示，随培养时间延长，除了Gly 处理使稻草腐解进程CHA先增加后略有降低外，其余各处理的CHA含量均逐渐升高。与0 d 相比，在培养结束时（90 d），Cat、Glu、Gly 处 理 和CK 的CHA含 量 分 别 增 加 了461.4%、657.1%、493.8%、281.8%，相比CK，添加3 种Maillard 反应前体物质均使CHA含量不同程度提升，其中，添加Glu 增幅最大。

图4 添加Cat、Glu 和Gly 对稻草腐解进程CHA 含量的影响

2.4 对稻草腐解进程CHA/CFA 的影响

作为评价腐殖质品质的重要指标，CHA/CFA值越大表明腐殖质品质越好。由图5 可见，随培养时间延长，各处理和CK 的CHA/CFA均表现为渐趋增高趋势。与0 d相比，培养结束时（90 d），Cat、Glu、Gly 处理和CK 的CHA/CFA分别增加151.6%、412.4%、312.4%和87.0%。可见，添加3 种Maillard 反应前体物质均能使CHA/CFA获得比CK 更大幅度的提升，相比之下，添加Glu 在改善腐殖质品质方面更有优势。

图5 添加Cat、Glu 和Gly 对稻草腐解进程CHA/CFA 的影响

3 讨论

在本试验条件下，无论是否添加Maillard 反应前体物质，稻草腐解过程均伴随着矿化的进行，TOC 含量渐趋降低。添加Cat、Glu 和Gly 促进了微生物对稻草的矿化分解，使TOC 含量下降幅度显著高于CK，添加Glu 降幅最大，下降了22.9%。Glu 和Gly 均为水溶性物质，前者为分子量较小的醛糖，空间位阻小，被视作HS 形成的主要贡献者[4]，而后者为结构简单的小分子氨基酸，既能作为微生物的氮源，又能成为不稳定的碳底物[3]，被微生物直接利用并合成自身生命体的能源物质。两者均能有效提高微生物多样性，促进微生物对稻草的矿化作用。Cat 是一种强还原剂，易被氧化成邻苯醌，属芳香族化合物，化学性质较稳定，微生物利用难度大于Glu 和Gly，但与稻草中的木质素相比，Cat 也可在一定程度上充当能源物质供微生物利用。刘娜等[9]研究指出，特定菌株在2 d 内对浓度低于700 mg/L Cat的降解率可高达90%，微生物通过酶催化、酶促反应和三羧酸循环，最终使Cat 降解为H2O 和CO2[10]。可见，外源添加的3 种Maillard 反应前体物质均可作为底物提升微生物活性，促进微生物对稻草的矿化作用。

HE 是堆肥过程产生的次生产物[11]，CHE含量可作为堆肥腐熟度评价及其农用效果的重要指标。与0 d相比，培养结束时（90 d），Cat、Glu、Gly 处理和CK 的CHE含量分别增加475.4%、456.8%、397.5%和386.5%。可见，与CK 相比，外源添加3 种Maillard 反应前体物质均可显著提高CHE含量。木质素-蛋白质理论和多酚-蛋白质理论涉及多酚和氨基酸之间的缩聚反应，是自然界中重要的腐殖化途径[4]，是邻苯二酚和甘氨酸能够对HE 形成有促进作用的重要依据。此外，微生物借助外部添加的邻苯二酚、葡萄糖和甘氨酸来腐解稻草，矿化作用的加剧使更多的稻草分解产物（芳香碳、羧基碳及羰基碳）被释放，为提升腐殖化作用创造了物质条件。Cat 属酚类物质，在多酚-蛋白质理论中，酚类是构成腐殖质分子核的关键成分[12]，促进生成HE。Glu 和Gly 是腐殖化作用的重要前体物质，且本身可以被微生物利用，最终以菌体的形式进入HE 使CHE含量升高。HE 碱溶液的色调系数（△lgK）可反映其分子的复杂程度，该值越大表明HE 分子结构越简单[13]。结合HE 碱溶液△lgK 的降低可以判断，不论是否添加Maillard 反应前体物质，稻草经腐解后HE 分子结构都更加复杂，尽管如此，添加Glu 和Cat 对稻草腐解过程HE 分子结构的复杂化程度不如CK，分析原因如下：微生物利用Glu 可使菌体中多糖含量增多、饱和度增高，同时合成了更多长链脂肪烃和不饱和碳链[14]，上述物质进入HE组分使其分子结构复杂程度低于CK；Cat 具有一定的生物毒性和强还原性，一定程度上不利于稻草木质素的氧化降解，干扰了微生物代谢[15]，限制了一部分芳香族产物进入HE，故而使HE 分子结构的复杂化程度低于CK，甚至有报道指出，Maillard 反应还解释了在多糖、还原糖和氨基酸参与，而多酚缺失的环境中仍然有HS 形成的现象[5]。Gly 的添加使培养体系过氧化氢酶活性增加[3]，提高了微生物对稻草木质素的氧化降解[16]，因此使HE 分子结构复杂程度显著高于CK。

HA 作为腐殖质中的活跃物质[17]，具有疏松多孔的网状结构，富含羧基、羟基、甲氧基和氨基[18]。在本试验中，无论添加Maillard 反应前体物质与否，经培养后稻草CHA含量均不同程度提高，其中3 种Maillard 反应前体物质处理下的CHA含量的增幅高于CK。分析其原因如下：Maillard 反应前体物质的添加可极大提高微生物对稻草降解后的腐殖化作用，使缩合产物进入HA 组分，进而使CHA含量提升幅度高于CK，其中Glu 的促进作用最为显著。在稻草腐解过程，为了充分表征腐殖质品质的变化，用CHA/CFA来描述HA 与FA 间转化的相对速度[7]。添加3 种Maillard 反应前体物质及CK 处理下的FA 的形成速率小于HA，总体表现为FA 逐渐向HA 转化。可判断，稻草完成腐解后，无论是否添加Maillard 反应前体物质，腐殖质品质均获不同程度提高，与STEVENSON[19]报道一致，即前体物质参与HS 的形成可增加其芳香性，使稻草腐解后的腐殖质品质显著高于CK，其中添加Glu 在改善腐殖质品质方面更有优势。

4 结论

随着培养时间延长，Cat、Glu、Gly 处理和CK 的TOC 含量均呈渐趋降低趋势，添加3 种Maillard 反应底物对TOC 矿化作用均有所促进，其中，Glu 的作用最为显著，使TOC 含量下降22.9%；历经培养，各处理均有利于CHE的增加并促进HE 分子结构复杂化，Cat 的添加使CHE获得最大幅度提高（475.4%），其次为Glu，Gly 的添加使HE 分子复杂程度达到最高；添加3 种Maillard 反应前体物质能够使CHA含量获得提高且改善腐殖质品质，相比之下，Glu 在提高CHA含量及改善腐殖质品质方面更胜一筹。综上，Glu 在促进稻草矿化分解、提升稻草腐解进程CHA含量、改善腐殖质品质方面更有优势，Cat 更有利于CHE含量的提升，而Gly 则更易促进HE 分子结构的复杂化。