凉山冕宁烟田节肢动物种类调查

侯园园,王 飞,江连强,徐蓬军,任广伟 ,王李芳*,王秀芳

(1.中国农业科学院烟草研究所,山东 青岛 266101; 2.四川省烟草公司泸州市公司,四川 泸州 646000;3.四川省烟草公司凉山州公司,四川 西昌 615000)

凉山州位于四川省西南部,属于亚热带季风气候区,地貌复杂,土壤肥力中等,是我国重要的烟草种植区,凉山烟区占全省烟草的60%以上,冕宁县是凉山重要的烟叶产区之一[1-3]。有研究通过空间扫描算法检测到四川凉山烟区为烟草病虫害高发区[4],而通过节肢动物调查,弄清农田的生物群落结构,使害虫的预测预报更加准确,有助于实施烟草病虫害的绿色防控[5]。刘旭等[6]对四川省大田生长期烟草害虫种类进行调查发现,烟田有昆虫纲7目、25科、70种及软体动物门腹足纲1目、3科、5种。目前对四川冕宁烟区节肢动物的调查主要针对半翅目害虫烟蚜(Myzuspersicae),对节肢动物种群动态的报道较少[7-8]。

随着分子生物学研究的深入,应用分子生物学技术鉴定昆虫物种,摆脱了虫态的限制,能够在分子生物学水平上获得精确的物种信息,该技术对传统昆虫形态学的鉴定起到了合理的补充。其中,DNA条形码技术(DNA barcoding)被认为是最简单、迅速、精确的方法,目前该技术在实蝇鉴定、姬小蜂科物种鉴定、蚜虫快速鉴定、鳞翅目害虫鉴定等方面也多有报道[9-13]。DNA条形码在世界范围内已经广泛用于生物物种鉴定,并逐渐成为一种有效的通用分类手段[14-16]。

研究主要通过目测法和扫网法[17]对四川凉山冕宁烟区的节肢动物种群进行普查,并利用DNA条形码技术对采集到的样品进行鉴定,为四川冕宁烟田害虫的预测预报、为烟田天敌的保护利用和烟田综合管理系统的建立提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 调查地烟田基本情况

试验在四川省凉山市冕宁烟区进行,试验田位于28°33′14″N,102°10′26″E,海拔1804m,属于亚热带季风气候区,雨热同期,土壤肥力中等,主栽品种为“云烟87”。

1.2 调查方法

调查时间于2020年7月,共设4个调查取样点,取样点随机区组排列,且每个小区面积不小于667m2,每个小区按5点法定点调查,每点10株。

1.2.1 目测法 每个小区共调查50株烟株,采取整体目测法,调查时先观察烟株叶片上的节肢动物,再全株调查,包括逐个剥开烟草的花、翻开叶片查看茎秆,同时对点内杂草上的节肢动物的种类和数量进行统计。

1.2.2 扫网法 捕虫网规格为网口直径30cm,网深35cm,杆长60cm。对烟株和烟株周围的杂草进行扫网,每次调查扫网50次(挥网一个来回为扫网1次),将采集到的节肢动物放于密封袋中或分别放入装有75%酒精的50mL离心管中,编号带回实验室。

1.3 节肢动物的分类

将采集到的节肢动物标本,在显微镜下进行分类鉴定,记录下节肢动物的种类和数量,对于无法鉴定的样本,进行编号记录[5],辅以分子鉴定。

1.4 节肢动物的分子鉴定

1.4.1 基因组总DNA的提取 将采集的样本用蒸馏水冲洗,放于滤纸上晾干后,使用天根细胞组织DNA提取试剂盒提取DNA,将提取的合格DNA样品放于4°C备用。

1.4.2 PCR扩增 使用Hebert等设计的引物扩增线粒体基因组中COI基因的DNA条形码序列,使用引物(MLepF1/R1)扩增采集样本的特异片段,引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

PCR反应的总体积为20μL,2×Taq PCR MasterMix 10 μL,上下游引物各0.5 μL,DNA模板1μL,dd H2O 8 μL。PCR反应条件为:94℃预变性3min;94℃变性1min,50℃退火1min,72℃延伸1min,共35个循环;最后72℃延伸10min。

将得到的PCR扩增产物进行基因片段片段纯化和双向测序。分别将使用引物(MLepF1/R1)得到的PCR产物进行凝胶电泳检测。

1.5 数据处理

使用SPSS 26对数据进行统计。测序结果返回后,使用MEGA 10软件对得到的正反向测序结果进行拼接,得到单条准确序列,采用BOLD数据库中的Identification-animal identification[COI]功能对每条DNA条形码序列进行比对,检查鉴定结果及相似度数据。从NCBI数据库中下载相应物种的DNA条形码序列,使用MEGA 10软件构建Neighbor-Joining树,以进一步确定分子鉴定的结果。

2 结果与分析

2.1 凉山冕宁烟田节肢动物普查

经过采集和鉴定,凉山冕宁烟田共调查到节肢动物有2纲8目10科16种,隶属昆虫纲(Insecta)和蛛形纲(Arachnida)。其中昆虫纲6目8科14种(表2),其中鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科害虫种类最多,包括烟青虫(Helicoverpaassulta)、甘蓝夜蛾(Mamestrabrassicae)、疆夜蛾(Peridromasaucia)、棉铃虫(Helicoverpaarmigera)、小地老虎(Agrotisipsilon)、粘虫(Mythimnaseparata)和弧金翅夜蛾(Thysanoplusiaorichalcea),鳞翅目害虫种类丰富,数量较少,仅占节肢动物总量的0.52%。半翅目害虫有烟蚜(Myzuspersicae)和烟粉虱(Bemisiatabaci),其中烟蚜种群数量最高,达到27.765头/株。鞘翅目害虫较少,包括泥红槽缝叩甲(Agrypnusargillaceus)。天敌害虫种类多,但数量低,包括隶属双翅目的食蚜蝇科(Syrphidae),隶属脉翅目的中华通草蛉(ChrysoperlasinicaTjeder),隶属膜翅目的烟蚜茧蜂(AphidiusgifuensisAshmead)和姬蜂科(Ichneumonidae),烟蚜茧蜂的数量较多为1.635头/株(表2)。蛛形纲2目2科2种,隶属寄螨目和蜘蛛目(表3)。

表2 烟田节肢动物发生数量

表3 烟田节肢动物物种组成

2.2 冕宁烟田节肢动物种类鉴定

对获得的20个COI基因序列进行编辑、拼接,利用MEGA 10软件构建系统发育树,结果共得到3科8种(表4)。测序得到长度为636 bp的COI基因序列,将20个样本的COI基因序列与BOLD数据库中DNA条形码序列进行比对,结果显示,4个样本的DNA条形码序列与甘蓝夜蛾标准序列的相似性均为100%,2个样本的DNA条形码序列与甘蓝夜蛾标准序列的相似性均为99.5%,1个样本的DNA条形码序列与甘蓝夜蛾标准序列的相似性均为99.3%。1个样本的DNA条形码序列与棉铃虫标准序列的相似性为100%,1个样本的DNA条形码序列与粘虫标准序列的相似性为100%,5个样本的DNA条形码序列与疆夜蛾标准序列的相似性均为100%,1个样本的DNA条形码序列与小地老虎标准序列的相似性为100%,1个样本的DNA条形码序列与弧金翅夜蛾标准序列的相似性为100%,3个样本的DNA条形码序列与棉铃虫齿唇姬蜂标准序列的相似性为99.53%,1个样本的DNA条形码序列与泥红槽缝叩甲标准序列的相似性为87.76%。

表4 物种鉴定比对

使用MAGA-10软件构建系统进化树(图1),结果发现,20个样本分属于鳞翅目,膜翅目,鞘翅目3个目,同一物种以较高的置信度聚为一小支,如疆夜蛾的5条序列以100%的置信度聚在一起。

图1 物种Neighbor-Joining聚类分析

3 讨论

烟田节肢动物群落在烟草旺长期至成熟初期,群落多样性最高,群落结构最稳定[18]。节肢动物群落的研究是烟草生长期有害生物综合防控的基础,目前,我国在烟田节肢动物方面开展了大量研究工作[19-22]。烟田节肢动物群落以刺吸类害虫、食叶类害虫及天敌为主,其中烟田节肢动物包括烟粉虱,烟蚜等优势种害虫以及烟蚜茧蜂、蜘蛛类等优势天敌[23-24]。研究主要对7月份四川冕宁烟区的节肢动物种类和数量进行调查,对冕宁烟区节肢动物调查的不足部分进行补充。通过对四川冕宁地区节肢动物进行调查发现,冕宁烟田共有2纲8目10科16种(昆虫纲6目8科14种,蛛形纲2目2科2种)。烟田害虫8种,其中半翅目发生情况最重,包括烟蚜和烟粉虱,烟蚜的发生量远高于烟粉虱,可能是由于在烟田烟蚜的种间竞争优势更大。其他害虫零星发生但也不能忽视,以避免次要害虫上升为主要害虫。烟田害虫天敌6种,寄生性天敌以烟蚜茧蜂为主,烟蚜茧蜂在田间对烟蚜的寄生率一般在20%～60%,寄生率最高达90%左右,是烟蚜的一种优势寄生性天敌[25],该天敌目前已在我国烟区大面积推广应用。明确冕宁烟区节肢动物种类,尤其是害虫和天敌的种类和数量,不仅能对烟田害虫的绿色防控提供指导,同时为烟蚜茧蜂在冕宁烟田的推广提供理论基础。

掌握烟田节肢动物组成是开展烟田绿色防控的重要前提[26-27]。本试验使用DNA条形码技术初步鉴定出烟田节肢动物16种,该技术应用范围广泛,使用一对通用引物便可以满足物种鉴定的需要,操作流程简单,可有效识别大量物种。然而,DNA条形码技术不能完全取代形态学分类,因此,在试验过程中将二者进行结合,以提高调查结果的科学性和准确性。通过普查和DNA条形码技术明确冕宁烟区的主要害虫及天敌,对今后烟田绿色防控及天敌昆虫在烟田的推广具有重要的指导意义。但试验仍存在不足之处,本试验采取定点定株的方法对四川冕宁地区的节肢动物群落进行调查,主要针对移动性弱、对寄主依附性强的类群,存在采集到的类群少于其他方法的弊端[5]。且调查时间短,不能全面反应冕宁烟田节肢动物发生情况,今后可进行多年、多点和更加全面的调查。