子宫内膜异位症患者miR-429与HIF-1α、VEGF水平和临床分期的相关性及其诊断效能*

刘佳, 张燕, 陈少丽

深圳市龙华区人民医院妇科(广东深圳 518109)

子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)是指子宫内膜基质细胞(endometrial stromal cells,ESCs)在子宫内膜腺体和细胞外基质生长所导致的一种较为常见的妇科疾病,是引起妇女不孕和盆腔疼痛的主要原因之一,其发病原因至今尚不清楚[1-2]。有研究表明,ESCs增殖、黏附、迁移及侵袭能力增强能促进子宫内膜组织异位生长和病变,抑制ESCs转移有利于改善EMs[3]。同时有研究表明,子宫内膜移位的原因可能与缺血有关,而缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)/血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)通路激活是引起EMs和血管生成的有效途径之一[4]。微小核糖核酸(microRNA,miR)主要是一种抑制基因表达的小型非编码RNA,其中miR-429是miR-200家属成员之一[5]。有研究表明,miR-429表达水平在EMs患者中明显升高,同时干扰miR-429表达水平能影响HIF-1α和VEGF水平,且miR-429 对ESCs的增殖、迁移和侵袭有一定影响作用[3]。但有关EMs患者miR-429水平与HIF-1α、VEGF水平及临床分期的相关性及其对EMs的预测价值未见报道。为此,本研究对135例EMs患者和80例非EMs健康育龄妇女的上述相关内容进行了对比分析,现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020年2月至2023年1月作者单位EMs确诊者135例为EMs组,年龄21～46岁,平均(32.67±9.03)岁。参照美国生殖医学协会EMs分期系统(r-AFS)将EMs组分为Ⅰ期(n=23)、Ⅱ期(n=35)、Ⅲ期(n=49)及Ⅳ期(n=28)。纳入标准:(1)所有EMs患者均符合2015年《子宫内膜异位症的诊治指南》中的诊断标准[6];(2)手术组织经病理切片确诊者;(3)年龄≥18岁;(4)初诊者;(5)患者及家属知情同意者;(6)自愿参与者;(7)近半年来未用激素类和(或)免疫抑制药物。排除标准:(1)伴有严重肝、肾功能不全者;(2)精神病者;(3)肿瘤者;(4)妊娠及哺乳者;(5)凝血功能异常者;(6)血液病者;(7)自身免疫性疾病者;(8)伴有代谢性疾病者;(9)不配合者;(10)中途退出者。

同时选取80例非EMs育龄妇女为对照组,年龄20～47岁,平均(30.96±8.74)岁。纳入标准:(1)≥18岁;(2)孕产≥1次;(3)自愿参与者。排除标准:(1)痛经者;(2)盆腔炎者;(3)下腹部疼痛者;(4)性交不适者;(5)月经异常者。年龄确保两组年龄差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究已经同作者医院伦理委员办公室批准同意{龙华人医伦审(研)[2022]第(014)号}。

1.2 仪器与试剂 HIF-1α、VEGF试剂盒(科顺公司,上海),miRNAs提取试剂盒和cDNA合成试剂盒(Takara,日本);SYBR Green Master Mix 试剂盒(Applied Biosystems,美国); ABI 7500 实时荧光定量PCR分析仪(ABI公司,美国);AE275酶免分析仪(爱康公司,深圳)。

1.3 方法

1.3.1 miRNAs提取 取静脉血3～4 mL于干燥管中,离心30 min(4℃,3 000 r/min),12 000 r/min离心10 min,然后取上层液采用RNAiso for Small RNA试剂盒进行提取,所有操作参照试剂盒说明书。

1.3.2 cDNA合成 将提取的miRNAs通过Mir-XTMmiRNA 第一链合成试剂盒在65℃下反转录10.0 min,所有操作参照试剂盒说明书。

1.3.3 miR-429水平 采用实时荧光定量-PCR(real-time quantitative PCR,RT-PCR)法进行血清miR-429水平,测定,具体操作流程参考文献[7]。

1.3.4 HIF-1α和VEGF水平测定 采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELSIA)对HIF-1α和VEGF水平进行测定,具体操作参照仪器和试剂盒说明。

2 结果

2.1 两组miR-429、HIF-1α及VEGF水平比较 EMs组miR-429、HIF-1α及VEGF水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 两组miR-429、HIF-1α及VEGF水平比较

2.2 不同临床分期miR-429、HIF-1α及VEGF水平比较 miR-429、HIF-1α及VEGF水平随EMs分期的加重而升高,不同临床分期之间差异明显(P<0.05),见表2。

表2 不同临床分期miR-429、HIF-1α及VEGF水平比较

2.3 EMs患者miR-429水平与其他指标的相关性 EMs患者miR-429水平升高,HIF-1α和VEGF水平也明显升高,经Pearman相关性分析,miR-429与HIF-1α和VEGF水平呈明显正相关(r=0.525 0,0.483 2,P<0.05);同时随EMs临床分期的加重而miR-429水平升高,经Spearman相关性分析,miR-429水平与临床分期呈正相关(r=0.751 0,P<0.05),见图1～3。

图1 EMs患者miR-429与HIF-1α水平相关性

图2 EMs患者miR-429与VEGF水平相关性

图3 EMs患者miR-429水平与临床分期相关性

图4 血清miR-429水平对EMs的预测价值

2.4 血清miR-429水平对EMs的预测价值 经ROC曲线分析,血清miR-429预测EMs的AUC为0.915(95%CI:0.877～0.953),特异度为72.98%,明显高于HIF-1α、VEGF检测指标(Z=2.405,2.756,P<0.05),但明显低于三者联合检测预测价值,而敏感度基本一致,见表3。

表3 血清miR-429水平对EMs的预测价值

3 讨论

EMs是育龄妇女常见和多发的一种雌激素依赖性良性疾病,但其病变部位广、形态不一,同时还具有恶性肿瘤的生物学特性(如转移、扩散、侵袭及复发等),可引起女性月经异常、痛经、盆腔慢性疼痛、异位结节及不孕,是导致不孕的常见原因之一,其发病率为10%～15%,占女性不孕的30%～50%,多发于30～40岁妇女,且呈逐年上升趋势,严重影响身心健康与生育功能[8-10]。但EMs发病机制复杂,早期症状不明显,甚至无症状,给早期诊断带来一定困难,易发生漏诊,使EMs病情进一步恶化[11-12]。因此,研究EMs有关临床诊断指标,对EMs早期诊断、治疗及发病机制研究具有重要的意义。

EMs发病机制十分复杂,至今尚未完全明确。有研究认为,子宫内膜移位最初的原因可能与缺血、缺氧有关[13]。miR是一类单链非编码内源性小分子RNA,长度为22～24个核苷酸,可通过与靶基因mRNA的3′非翻译区(3′untranslated region, 3′UTR)完全或不完全互补配对后发挥负性调控作用,从而参与细胞增殖、分化及凋亡过程[14],其中miR-429是miR-200大家族成员之一,是低氧反应的miR之一,可通过调控细胞增殖、分化及衰老凋亡而在肿瘤发病中发挥着重要的作用,但表达水平不一,在多数肿瘤中,miR-429发挥抑制性作用,抑制肿瘤的发生。但也有研究表明,miR-429在一些癌症中起促进作用,如膀胱癌和卵巢癌患者组织和(或)细胞中miR-429水平明显上调,其过度表达可促进癌细胞增殖、迁移,减少癌细胞凋亡,从而促进肿瘤生长。同时有研究发现,EMs患者miR-429水平呈过度表达,可增强ESCs的增殖、侵袭及迁移能力,干扰 miR-429 表达后,ESCs增殖、侵袭及迁移能力受到抑制。此外,miR-429过表达还可逆转小檗碱对细胞增殖、侵袭及迁移的抑制作用,从而促进肿瘤发展[3,15-17]。本研究结果显示,EMs患者血清中miR-429水平明显升高,且与临床分期呈明显正相关,这表明miR-429过表达与EMs发病密切相关,这可能与miR-429过表达促进EMs患者ESCs增殖、侵袭及迁移有关。

HIF-1α是对缺氧环境能及时产生反应的一种转录调控因子,是促进肿瘤新生血管生成的核心因子,在肿瘤侵袭过程中新生血管形成的环节上发挥着重要的作用,其作用主要是通过其靶基因VEGF来实现的。而近来研究发现,EMs发病中最关键的一环是新生血管生成,而VEGF是人体内最强的一种促血管生成因子,又是HIF-1α调节的一种最重要的靶基因,能特异性作用于血管内皮细胞上,不仅能促使新生血管生成,且在EMs发生发展过程中发挥着重要的作用[18-19]。本研究结果显示,EMs患者血清中HIF-1α、VEGF水平明显升高,这说明缺氧可能是EMs发病的一个诱因,子宫内膜组织缺氧,HIF-1α蛋白降解减少,导致其过表达,从而激活VEGF靶基因转录,子宫内膜迁移、种植到宫腔外其他部位,体积增大,进一步加重局部缺氧,进而HIF-1α通过调控VEGF基因使VEGF呈高表达,从而促使血管生成[20]。同时结果显示,EMs患者miR-429水平与HIF-1α、VEGF水平呈正相关,这说明miR-429过表达还可能通过激活HIF-1α/VEGF通路,促使新血管生成而在EMs发病中发挥作用有关,具体的作用机制有待进一步研究。此外,结果还显示,miR-429、HIF-1α及VEGF单独及三者联合检测对EMs诊断均有很高的敏感度,但联合检测的特异度最高,提示三者联合检测更有利于EMs诊断和病情评估,具有更高的预测价值。

综上所述,EMs患者血清中miR-429水平明显升高,且与HIF-1α、VEGF水平及临床分期呈明显正相关。同时miR-429、HIF-1α及VEGF三者联合检测对EMs患者诊断和病情评估比单独检测具有更好的预测价值,值得临床推广应用。

利益相关声明：本文不涉及任何相关利益冲突。

作者贡献说明：刘佳负责提出研究选题、方案、实施、采集及数据整理和分析;张燕负责调研整理文献、设计论文框架、起草论文、修订论文、终审论文;陈少丽负责获取研究经费、技术或材料支持和指导性支持。