血清ATX、Angptl4、S100 A12与脓毒症并发ARDS患者NLRP3炎性小体及预后的关系*

燕莎, 朱亚, 杨建旭, 付毓平, 牛小斌, 李永伟△

1河南省中医院(河南中医药大学第二附属医院)检验科 (河南郑州 450002); 河南省人民医院 2检验科, 3重症医学科(河南郑州 450002); 4新乡医学院三全学院医学检验学院 (河南新乡 453000)

脓毒症是一种机体免疫系统对感染反应失调引起的一种危及生命的器官功能障碍综合征,是重症医学科常见疾病,病情凶险,可导致多器官功能障碍,病死率极高[1]。急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是脓毒症常见并发症之一,临床研究显示,脓毒症并发ARDS发病率可达50%以上,病死率在40%左右,较未合并ARDS的患者显著升高[2]。并发ARDS是导致脓毒症病情恶性进展的重要危险因素,临床尚无特效治疗药物,仅能对症支持治疗。故寻找可靠的血清标志物评估脓毒症并发ARDS患者近期死亡风险,有助于掌握病情变化及时调整治疗策略。目前脓毒症并发ARDS的机制尚不明确,过度炎症反应、内皮功能紊乱均与其发生有关,生理状态下各细胞因子之间相互作用形成平衡的网络系统,一旦网络系统的平衡被打破则可能诱发炎症“瀑布反应”,致使全身器官损害,导致ARDS[3]。因此,寻找能够反映ARDS发病过程中炎症反应的相关血清标志物,进而在疾病发生早期对病情进展作出预期判断,将利于采取更合适的治疗策略以改善预后。研究[4-6]已证实,自分泌运动因子(autotaxin,ATX)、血管生成素样蛋白4(angiopoietin-like protein 4,Angptl4)、S100钙结合蛋白A12(S100 calcium-binding protein A12,S100A12)均能参与机体炎症反应过程,与炎症相关疾病进展过程密切相关。NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor pyrin domain containing 3,NLRP3)炎症小体参与调控炎症反应,其作为脓毒症所致急性肺损伤/ARDS发病的核心已被证实[7],因此探讨三项血清指标在脓毒症并发ARDS过程中的作用及其与NLRP3炎症小体及预后转归关系有重要临床意义。关于ATX、Angptl4及S100A12表达水平与ARDS病情进展有关的NLRP3炎症小体有何关系尚未明确,为此,本研究通过检测ATX、Angptl4及S100A12在脓毒症合并ARDS患者循环血中表达水平,并分析三指标与NLRP3炎症小体及其细胞因子及患者近期预后之间的关系,为脓毒症并发ARDS的临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年1月至2022年4月收治的303例脓毒症患者,其中男178例,女125例;年龄46～77岁,平均(65.80±6.15)岁,根据是否合并ARDS分为ARDS组(106例)和非ARDS组(197例)。

纳入标准:(1)脓毒症患者符合脓毒症及脓毒性休克第3次国际共识定义(Sepsis-3)[8],经病原学检查明确感染部位;(2)ARDS纳入标准依据2012 ARDS柏林定义[9]:①急性起病(≤7 d);②氧合指数(OI)低于200 mmHg;③胸片提示双侧浸润影、不能用积液、大叶/肺不张或结节完全解释;④呼吸衰竭不能用心力衰竭或液体过度负荷完全解释,并用超声心动图排除静水压增高型肺水肿;(3)年龄>18岁;(4)入组前未接受脓毒症及ARDS相关治疗;(5)患者或家属签订知情同意书。

排除标准:(1)伴器质性心脏病者;(2)有哮喘、肺气肿、慢性肺间质纤维化、肺结核、肺栓塞等病史者;(3)伴自身免疫性疾病或近期服用免疫抑制剂、激素药物者;(4)血液系统疾病者;(5)放弃抢救或治疗期间转院者;(6)孕妇及哺乳期女性。

本研究已通过我院医学伦理委员会审批(HNSZYY-20190010005)。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 入院1 h内采用不含EDTA的真空管采集静脉血10 mL,非抗凝血样室温静置20 min后,2 800 r/min离心15 min(直径12 cm)取上层血清,-80℃备用;入院第1天用含EDTA抗凝真空管采集静脉血5 mL,按照1∶1体积与人外周血淋巴细胞分离液(北京索莱宝科技有限公司)混匀,离心分离外周血单个核细胞(PBMCs),与2 mL Trizol(日本TaKaLa)混合后置于-80℃备用。

1.2.2 血清ATX、Angptl4、S100A12、白细胞介素(IL)-1β及IL-18水平的检测 采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清ATX、Angptl4、S100A12,ATX、Angptl4、S100A12 ELISA试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司(货号:ZN2032、ZN2027、ZN2393),IL-1β、IL-18 ELISA试剂盒购自英国Abcam公司(货号ab214025、ab264615),按照试剂盒说明书于450/570 nm波长处测量吸光度值,根据标准曲线计算待测样中ATX、Angptl4、S100A12、IL-1β及IL-18的水平。

1.2.3 外周血NLRP3检测 采用实时荧光定量聚合酶链反应检测PBMCs中NLRP3 信使核糖核酸(mRNA)表达情况,Trizol法提取总RNA,检测RNA浓度,并反转录合成互补链DNA(cDNA)。qPCR引物(上海生工生物公司设计与合成):NLRP3:F:5′-ACTGATGCTGGGTACGTCTCC-3′,R:5′-TAGCGGCATGAGCTAGTCG-3′,β-actin:F:5′-ACGTAGCTGATGCTGATCGC-3′,R:5′-TATGCTAGCTAGCTGACGTG-3′,根据SYBR Green qPCR Mix试剂盒(上海铼博生化科技有限公司)建立20 μL反应体系:SYBR Premix Ex Taq 8.5 μL,正反向游引物各1 μL,cDNA 2 μL,ddH2O 7.5 μL;反应条件:94 ℃预变性3 min;38个循环(94 ℃变性10 s,59 ℃退火30 s),72 ℃延伸60 s,2-ΔΔCT法分析目的基因相对表达强度。

1.2.4 资料收集 收集脓毒症患者的基本资料,包括性别、年龄、体质指数(BMI)、吸烟史、饮酒史、合并症(高血压、糖尿病、冠心病)、感染部位(尿路感染,腹腔感染,静脉置管、气管插管、导尿管等引起的导管相关血流感染),是否休克、侵入性置管,有无使用血管活性药,记录机械通气时间、重症监护室(ICU)入住时间,入院24 h内评估急性生理与慢性健康评分Ⅱ(APACHE Ⅱ)[10]、序贯器官衰竭评估(SOFA)评分[11],GEM Premier 3000全自动血气分析仪(美国IL)监测血气参数:动脉二氧化碳分压(PaCO2)、动脉氧分压(PaO2)、OI及动脉血乳酸水平,采用全自动生化分析仪(雅培C1600)及配套试剂检测白蛋白、血糖、血肌酐水平。APACHE Ⅱ包括A项(急性生理学评分,12项生理参数,每项0～4分,总分0～48分)、B项(年龄,0～6分)、C项(慢性健康评分,0、2、5分)三个部分,分值越高病情越严重。SOFA评分涉及呼吸、凝血、肾脏等6个器官系统功能,每项0～4分,总分0～24分,分数越高多器官功能障碍程度越高。

1.2.5 治疗及随访结果统计 脓毒症并发ARDS患者入住ICU,根据《脓毒症并发急性呼吸窘迫综合征的治疗策略》[12]推荐方案治疗,包括呼吸支持、抗炎、抗凝血、血管活性药物、液体管理等,若合并糖尿病、高血压等基础疾病给予相应对症治疗,记录入院30 d死亡情况,并分为死亡组(n=49)和生存组(n=57)。

2 结果

2.1 ARDS组和非ARDS组血清ATX、Angptl4、S100A12、NLRP3、IL-1β及IL-18水平比较 ARDS组血清ATX、Angptl4、S100A12、NLRP3、IL-1β及IL-18水平均高于非ARDS组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 ARDS组和非ARDS组血清ATX、Angptl4、S100A12、NLRP3、IL-1β及IL-18水平比较

2.2 血清ATX、Angptl4、S100A12与NLRP3、IL-1β和IL-18表达水平的相关性分析 Pearson相关性分析显示,血清ATX、Angptl4、S100A12与NLRP3 mRNA、IL-1β、IL-18水平均呈正相关(P<0.05)。见表2。

表2 血清ATX、Angptl4、S100A12与NLRP3、IL-1β和IL-18表达水平的相关性分析

2.3 不同预后脓毒症并发ARDS患者临床资料及实验室指标比较 住院期间脓毒症并发ARDS患者死亡率为46.23%(49/106),死亡组年龄、APACHE Ⅱ评分、SOFA评分、血乳酸、血清ATX、Angptl4、S100A12水平及休克、机械通气时间≥3 d、ICU入住时间≥10 d、侵入性置管占比均高于生存组,OI、白蛋白水平低于生存组(P<0.05)。两组性别、BMI、吸烟史、饮酒史、合并症、感染部位、血管活性用药、PaCO2、PaO2、血肌酐、血糖水平方面比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 不同预后脓毒症并发ARDS患者临床资料及实验室指标比较

2.4 Logistic回归分析脓毒症并发ARDS患者住院期间死亡的危险因素 以脓毒症并发ARDS患者住院期间死亡为因变量,以表3中生存组与死亡组存在差异的因素为自变量纳入进行logistic回归(受本研究样本量限制,仅进行单因素回归),赋值设计见表4。Logistic回归结果显示,入院时APACHE Ⅱ、SOFA评分、血清ATX、Angptl4、S100A12升高均是导致患者死亡的危险因素(P<0.05)。见表5。

表5 Logistic回归分析脓毒症并发ARDS患者住院期间死亡的危险因素

2.5 血清ATX、Angptl4、S100A12对脓毒症并发ARDS患者住院期间死亡的预测价值 以死亡组为阳性样本(n=49),以生存组为阴性样本(n=57),以血清ATX、Angptl4、S100A12为自变量(连续数值原型输入)进行多因素logistic回归,建立风险预测模型,以其Logit(P/1-P)=-0.039+0.091×ATX+0.009×Angptl4+0.024×S100A12为联合应用的虚拟概率量指标,再行ROC曲线分析。ROC曲线分析显示,血清ATX、Angptl4、S100A12及三者联合预测脓毒症并发ARDS患者住院期间死亡的AUC(95%CI)分别为0.729(0.455～0.984)、0.708(0.501～0.922)、0.780(0.596～0.959)、0.852(0.712～0.985),三血清指标联合预测效能高于单项检测。见表6、图1。

图1 血清ATX、Angptl4、S100A12对脓毒症并发ARDS患者死亡的预测ROC曲线

表6 血清ATX、Angptl4、S100A12对脓毒症并发ARDS患者住院期间死亡的预测价值

3 讨论

ARDS是脓毒症常见并发症,其发病机制十分复杂。ATX是溶血磷脂酸生成相关的关键酶,参与增殖、转移等细胞生物学过程,与多种炎症及纤维化疾病有关[13]。研究显示[14],致癌物二氧化硅颗粒能在呼吸道上皮细胞中引起NLRP3依赖性线粒体去极化及ATX活化,从而引起DNA损伤,加入ATX抑制剂能阻止NLRP3依赖性线粒体去极化,提示ATX与NLRP3密切相关。Angptl4是Angptl家族成员之一,该家族成员具有血管生成素(Ang)相似结构,但功能上却有明显差异,在糖脂代谢紊乱、炎症等疾病中起重要调控作用[15]。Wu等[16]研究显示,慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者循环血中Angptl4水平升高,且与肺部多种炎症因子有关;NLRP3炎症小体活化介导炎症反应在COPD及其他肺部炎症疾病中的作用已有多项研究证实[17-18],推测Angptl4与NLRP3炎症小体活化有关。S100A12是S100钙结合蛋白家族成员之一,主要表达于骨髓细胞及受损细胞中,当细胞损伤或发生炎症反应时大量表达,参与调控促炎反应。有研究[19]发现,S100A12可作为特发性肺纤维化患者病情严重程度及预后的标志物。从上述研究可知,ATX、Angptl4及S100A12表达水平与炎症反应密切相关,推测三者可能参与脓毒症患者ARDS的发生和发展过程。NLRP3炎症小体是一种多蛋白复合体,活化后可产生多种炎症因子如IL-1β、IL-18及细胞焦亡因子的释放,在机体急慢性炎症性疾病中发挥重要作用[20]。多种病因导致的ARDS发病实质上是一种过度炎症反应,已有研究证实,NLRP3炎症小体的形成和活化参与ARDS病情进展,且有望成为该病治疗的潜在靶点[21]。

本研究发现,ARDS组血清ATX、Angptl4、S100A12、NLRP3、IL-1β及IL-18水平均高于非ARDS组,提示脓毒症并发ARDS患者血清ATX、Angptl4、S100A12水平升高。炎症反应在脓毒症并发ARDS进程中发挥关键作用,血清ATX、Angptl4、S100A12水平与炎症反应密切相关。Trovato等[22]报道,急性-慢性肝衰竭患者血清ATX水平升高,与IL-6、肿瘤坏死因子-α相关,且能促进溶血磷脂酸依赖性PBMCs活化,引起全身炎症反应,导致病死率增加;Jia等[23]报道ATX在ARDS、非纤维化、病毒性肺炎中均表达升高,提示ATX可作为多种肺部疾病的潜在治疗靶点。说明ATX能通过促进炎症反应参与加重呼吸系统重症风险。动物学研究[24]显示,沉默Angptl4可抑制核因子-κB介导的炎症反应,从而减少骨关节炎小鼠局部炎症反应;另有报道证实Angptl4上调能加重胰腺腺泡细胞损伤,从而加重胰腺炎[25],说明Angptl4参与多种急慢性炎症疾病进展。Qiu等[24]研究显示,入院时血清S100A12水平高与急性原发性脑出血患者炎症反应程度有关,且与神经功能恶化高度相关能够反映疾病预后转归;Cem等[25]发现,S100A12水平在大动脉炎患者粪便样本中升高,能够反映肠道受累程度及大动脉炎活动度。这说明S100A12在多种炎症性疾病中高表达。从上述研究可知,ATX、Angptl4、S100A12均能促进炎症介质的释放,而本研究通过相关性分析可知,ATX、Angptl4、S100A12与NLRP3 mRNA及其细胞因子(IL-1β、IL-18)水平均呈正相关,分析其可能原因为脓毒症并发ARDS实质上是炎症反应失控所致,外源性因素诱发炎症小体活化,ATX、Angptl4、S100A12水平升高进一步促进炎症因子释放,释放的炎症因子之间又存在相互作用,导致肺毛细血管内皮细胞及上皮细胞进一步受损,肺水肿加剧,最终导致疾病恶化、进展。

本研究采用logistic回归分析法剔除了年龄、血乳酸、OI、白蛋白、是否休克等因素后发现,入院时APACHE Ⅱ、SOFA评分、血清ATX、Angptl4、S100A12高水平均是导致患者死亡的危险因素,提示血清ATX、Angptl4、S100A12升高与并发ARDS的脓毒症患者近期预后关系密切。APACHE Ⅱ与SOFA评分是评估危重症患者病情程度及预后的常用指标,APACHE Ⅱ评分对预后预测的敏感度更好。血清ATX、Angptl4、S100A12高水平同样能够增加脓毒症并发ARDS近期死亡风险,分析可能与其能够促进机体炎症反应有关。Araki等[26]研究认为,血清ATX可通过促进溶血磷脂酸的产生促进心肌炎症及纤维化,从而导致扩张型心肌病不良临床结局增加风险;Jung等[27]在胰腺炎研究中发现,Angptl4可促进胰腺炎炎症反应,加重胰腺炎严重程度;Angptl4是慢性间质性肺炎肺纤维化的关键调节因子,在肺纤维化急性期至慢性期的肺组织中显著上调。说明Angptl4可能通过促进炎症反应,从而不利病情转归。Åberg等[28]研究显示,转移性前列腺癌患者血浆S100A12水平和PBMCs计数增多,两者水平升高与前列腺癌预后生存期缩短有关;S100A12水平与社区获得性肺炎病情严重程度、炎性细胞因子相关,其水平升高提示住院期间死亡风险升高。上述研究说明ATX、Angptl4、S100A12可通过促进机体中过度的炎症反应进一步失控,大量炎性细胞滞留于肺组织内被激活,炎症“瀑布样连锁反应”启动,大量促炎介质进入血液循环,肺部及全身性炎症反应加剧,导致预后死亡风险增加。本研究进一步经ROC曲线分析发现,血清ATX、Angptl4、S100A12及三者联合预测脓毒症并发ARDS患者住院期间死亡的AUC(95%CI)分别为0.729(0.455～0.984)、0.708(0.501～0.922)、0.780(0.596～0.959)、0.852(0.712～0.985),三血清指标联合预测效能高于单项检测,说明联合检测血清ATX、Angptl4、S100A12有助于脓毒症并发ARDS患者短期预后的判断。

综上所述,脓毒症并发ARDS患者血清ATX、Angptl4、S100A12水平升高,与NLRP3炎性小体及其细胞因子关系密切,且是影响患者住院期间病情转归的独立危险因素,联合检测血清ATX、Angptl4、S100A12有助于脓毒症并发ARDS患者短期预后的判断。提示临床中可通过监测脓毒症患者ATX、Angptl4、S100A12水平变化了解患者病情进展,及时实施合理有效的措施改善患者的临床结局。

利益相关声明：所有作者声明无利益冲突。

作者贡献说明：燕莎:酝酿和设计试验、实施研究、采集数据、分析/解释数据、起草论文;朱亚、杨建旭:支持实施研究、分析/解释数据、对论文的知识性内容作批评性审阅、技术或材料支持;付毓平:支持实施研究、对论文的知识性内容作批评性审阅、指导;牛小斌、李永伟:支持实施研究、获取研究经费及行政、采集数据、对论文的知识性内容作批评性审阅、指导。