非小细胞肺癌患者瘤组织LncRNA LINC00460、miR-98-5p的水平及临床意义*

王敏, 苗玲, 赵之寒

邯郸市中心医院胸外科(河北邯郸 056000)

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是主要肺癌类型,占比约为80%[1]。因其发病隐匿,早期无特异性体征,就诊时多数患者已发展至中晚期,错失最佳手术时机,仅可实施姑息性放化疗,但疗效不佳。数据显示,晚期NSCLC术后患者5年生存率仅约15%,且具有较高复发风险[2]。因此积极探索NSCLC发病机制及分子生物学特点,明确有效的诊断依据及治疗靶点成为目前临床热点研究课题。长链非编码RNA(lncRNA)是无蛋白质编码的RNA,可在基因组转录、转录后水平及表观遗传学等层面调控基因表达[3]。已有研究证实结直肠癌、肝癌、胃癌中lncRNA生物学功能,与肿瘤侵袭、增殖、发生有关,可为临床诊断、治疗提供重要参考依据[4-6]。微小RNA(miRNA)是内源非编码RNA,可调控基因表达,已有研究证实其可参与细胞增殖、分化、凋亡、恶性转化等过程[7]。但目前NSCLC分子生物学研究中有关lncRNA、miRNA的报道较少。本研究通过分析NSCLC癌组织LncRNA LINC00460、miR-98-5p表达与病理特征间关系及KM曲线,旨在为NSCLC发病机制及靶向治疗提供依据。报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年1月至2018年12月我院NSCLC患者57例,另取距肿瘤边缘2 cm癌旁组织设为对照。其中女22例,男35例,年龄43～78岁,平均(60.25±8.51)岁,TNM分期:9例Ⅰ期,21例Ⅱ期,27例Ⅲ期。本研究经医院伦理委员会审批通过(审批号:20161205)。

纳入标准:(1)病理诊断证实为NSCLC,符合《2017 ESMO临床实践指南:早期和局部进展非小细胞肺癌的诊断,治疗和随访》[8]中NSCLC诊断标准;(2)均给予手术治疗,术前无放化疗史或其他辅助治疗史;(3)依从性良好,精神正常,能良好配合。

排除标准:(1)伴有慢阻肺、支气管哮喘、支气管哮喘等其他肺部疾病;(2)合并药物过敏史、急性感染、血液性疾病、心肾肝等功能障碍;(3)合并近3个月抗生素使用史或其他部位肿瘤;(4)中途退出或临床资料不全。

1.2 方法

1.2.1 采集样本 留取术中癌组织及距肿瘤边缘2 cm癌旁组织,液氮罐冻存24 h,之后冷冻(-70℃)保存。

1.2.2 检测癌组织及癌旁组织miR-98-5p、LncRNA LINC00460表达量 解冻标本组织,超声处理,提取总RNA,First Strand cDNA Synthesis Kit/miScript Reverse Transcription Kit合成cDNA,通过qRT-PCR仪及TaqMan®Universal Master Mix扩增、检测cDNA。作用条件:预变性(94℃)4 min,变性(93℃)15 s,退火(64℃)30 s,40个循环。GAP-DH、U6作为内参,miR-98-5p引物:正向:5′-AGGATTCTGCTCATGCCAG-3′,反向:5′-TGAATATGCCACACACCAG-3′;LncRNA LINC00460引物:上游5′-ACAGCAT-GAGCCAGGA-CATC-3′,下游5′-GAAAGCTGCAACAT-GCTCCC-3′。通过2-ΔΔCt法计算miR-98-5p、LncRNA LINC00460相对表达水平。

1.2.3 收集病理特征 查阅病历记录,收集患者年龄、性别、肿瘤直径、病理分型、临床分期、淋巴结转移、分化程度、手术方式等。

1.2.4 随访 随访起点设为手术当日,开展门诊或电话随访,患者死亡或2021年12月31日为随访终点,统计术后总生存率。至随访结束,共21例(36.84%)死亡。

1.3 观察指标 (1)癌组织及癌旁组织miR-98-5p、LncRNA LINC00460表达。(2)癌组织miR-98-5p、LncRNA LINC00460表达与病理特征的相关性。(3)不同癌组织miR-98-5p、LncRNA LINC00460表达患者总生存率。(4)死亡及存活患者癌组织miR-98-5p、LncRNA LINC00460表达。(5)癌组织miR-98-5p、LncRNA LINC00460表达与患者预后的关系。(6)分析miR-98-5p、LncRNA LINC00460对患者预后评估价值。

2 结果

2.1 癌组织及癌旁组织miR-98-5p、LncRNA LINC00460表达 癌组织miR-98-5p表达低于癌旁组织,LncRNA LINC00460表达高于癌旁组织(P<0.05),见表1、图1～2。

表1 癌组织及癌旁组织miR-98-5p、LncRNA LINC00460表达

图1 miR-98-5p表达

图2 LncRNA LINC00460表达

2.2 癌组织miR-98-5p、LncRNA LINC00460表达与病理特征的相关性 癌组织miR-98-5p、LncRNA LINC00460表达与年龄、性别、病理分型、肿瘤直径、手术方式无关(P>0.05);癌组织miR-98-5p、LncRNA LINC00460表达与临床分期、分化程度、淋巴结转移有关(P<0.05),见表2。

表2 癌组织miR-98-5p、LncRNA LINC00460表达与病理特征的相关性

2.3 不同癌组织miR-98-5p、LncRNA LINC00460表达患者总生存率 以癌组织miR-98-5p、LncRNA LINC00460表达均值为界分高表达、低表达,其中miR-98-5p高表达23例,低表达34例;LncRNA LINC00460高表达30例,低表达27例。Kaplan-Meier生存分析显示,癌组织LncRNA LINC00460高表达者总生存率低于低表达者(2=5.338,P=0.021),癌组织miR-98-5p高表达者总生存率高于低表达者(2=6.732,P=0.010),见图3、4。

图3 不同miR-98-5p表达患者生存情况

图4 不同LncRNA LINC00460表达患者生存情况

2.4 死亡及存活患者癌组织miR-98-5p、LncRNA LINC00460表达及术后治疗方式 死亡者癌组织miR-98-5p表达低于存活者,LncRNA LINC00460表达高于存活者(P<0.05);死亡者与存活者术后治疗方式对比,差异无统计学意义(P>0.05),见表3、4。

表3 死亡及存活患者癌组织miR-98-5p、LncRNA LINC00460表达

表4 死亡及存活患者术后治疗方式 例(%)

2.5 癌组织miR-98-5p、LncRNA LINC00460表达与患者预后的关系 以患者预后情况作为因变量(死亡=1,存活=0),以癌组织miR-98-5p、LncRNA LINC00460表达(<均值赋值为1,≥均值赋值为2)、年龄(<60岁=1,≥60岁=2)、性别(男=1,女=0)、病理分型(腺癌是=1,否=0)、肿瘤直径(<3 cm=1,≥3 cm=2)、临床分期(Ⅰ期=1,Ⅱ期=2,Ⅲ期=3)、淋巴结转移(是=1,否=2)、分化程度(低分化=1,中分化=2,高分化=3)、手术方式(单侧全肺切除是=1,否=0)作为自变量,进行多因素logistic回归分析,得到方程logit(p)=-0.848×miR-98-5p+1.245×LncRNA LINC00460+1.491×临床分期+1.335×淋巴结转移+1.469×分化程度,证实控制临床分期、淋巴结转移、分化程度混杂变量后,miR-98-5p表达降低、LncRNA LINC00460表达升高仍是NSCLC患者死亡的独立危险因素(P<0.05),见表5。

表5 癌组织miR-98-5p、LncRNA LINC00460表达与患者预后的关系

2.6 miR-98-5p、LncRNA LINC00460评估患者预后的列线图分析 根据2.5 logistic回归方程筛选出的miR-98-5p、LncRNA LINC00460、临床分期、淋巴结转移、分化程度构建列线图预测模型,校准曲线分析结果显示,列线图预测模型评估NSCLC患者病死的风险与实际病死风险吻合度较高(经Hosmer-Lemeshow拟合优度检验,2=6.902,P=0.547),见图5、6。

图5 miR-98-5p、LncRNA LINC00460评估患者预后的列线图

图6 校准曲线

3 讨论

NSCLC是一种呼吸系统肿瘤,病死率、患病率较高。手术是目前主要治疗手段,但因其创伤性、高复发率,临床预后不甚理想。故积极寻求与NSCLC发生有关,且能评价预后的标志物有积极意义。

基因组学表明,人类基因组仅2%左右可编码蛋白质,其他部分由非编码RNA构成[9]。大量证据显示,肿瘤发生过程可能有非编码RNA参与[10]。从而可为生物学层面研究肿瘤提供新视角。lncRNA能调控免疫应答、炎症反应、染色体重构、个体发育、自噬、氧化应激、细胞凋亡/增殖等,与肺癌、慢性阻塞性肺疾病等有关[11]。研究表明,NSCLC患者癌组织lncRNA GABPB1-IT1表达下调,lncRNA GAS5呈过表达,均能作为NSCLC诊断、预后评估指标[12-13]。上述结果表明,lncRNA表达与NSCLC病理变化有关。LncRNA LINC00460是lncRNA中一员,结直肠癌瘤组织中表达升高,可调控p-Akt信号通路,促进/抑制癌细胞血管形成及细胞增殖[14]。丁梦杰等[15]研究表明,NSCLC癌组织LncRNA LINC00460表达上调,其表达水平能反映NSCLC恶性程度。本研究结果支持上述研究,癌组织LncRNA LINC00460表达高于癌旁组织,且与分化程度、临床分期、淋巴结转移有关(P<0.05)。推测LncRNA LINC00460能与相关基因靶向结合,调控有关信号通路,抑制NSCLC细胞凋亡,促进癌细胞迁移、增殖,从而参与NSCLC发生、进展过程。进一步研究发现,LncRNA LINC00460高表达是NSCLC患者预后死亡的独立危险因素,且表达高者生存率低于低表达者。LINC00460是人13号染色体DNA(106376563-106377792)转录产物,可影响间质、上皮转化过程,诱导肺癌细胞侵袭、转移;同时其能竞争性结合RNA,吸附miR-302c-5p,调控FOXA1表达,起到促癌效果[16-17]。因此LncRNA LINC00460表达能反映NSCLC恶性进程及预后情况。但其在NSCLC中高表达的确切机制尚未清楚,仍需进一步研究。

miRNA属于非编码RNA之一,能调节血管生成、生长发育,调控细胞分化、增殖、迁移、凋亡,参与炎症、免疫反应[18]。miR-98-5p是miRNA中一员,张晓莹等[19]研究指出,miR-98-5p可调控HMGA2,延缓喉鳞癌进程。KE等[20]研究显示,miR-98-5p能与α-1,3-甘露糖转移酶靶向结合,控制NSCLC进展。支持本研究结果,NSCLC患者癌组织miR-98-5p低表达与临床分期、淋巴结转移、分化程度有关,且是NSCLC患者预后死亡的独立危险因素。分析原因可能与miR-98-5p能和相关基因靶向结合,调节信号转导有关。另外本研究Kaplan-Meier生存分析表明,癌组织miR-98-5p低表达者生存率低于高表达者。分析相关机制:肺泡巨噬细胞(AMs)是主要肺部固有免疫细胞,其中M1型能分泌促炎因子,刺激炎症进展,而M2型能抑制炎症,减轻肺损伤[21]。研究[22]表明,miR-98-5p高表达能介导AMs向M1转化,抑制其分化成M2型。同时有研究表明,LncRNA 能通过吸附miRNA而抑制miRNA表达及活性,如LncRNA LINC00460能吸附miR-98-5p继而抑制miR-98-5p在抗肿瘤中的生物学活性,导致IL-β、IL-6等促炎因子分泌增加[23-24]。因此LncRNA LINC00460低表达,miR-98-5p高表达能抑制炎症反应,减轻肺损害。进一步绘制列线图模型分析发现,所构建模型评估NSCLC患者病死的风险与实际病死风险具有较高一致性,呈现出较高预测价值,可指导临床积极完善干预策略。

综上,NSCLC患者癌组织miR-98-5p表达异常下降,LncRNA LINC00460表达异常升高,且与临床分期、淋巴结转移、分化程度等病理特征有关;同时也是影响NSCLC患者生存的重要原因,与预后不良密切相关。但本研究仍有以下不足:(1)样本量小。(2)未纳入放化疗史患者,可能一定程度影响研究结果。因此后期需增加样本量,并收集完善信息,进一步阐明LncRNA LINC00460、miR-98-5p表达水平对NSCLC患者的作用机制及临床意义。

利益相关声明：不存在利益冲突。

作者贡献说明：王敏:论文撰写;苗玲:数据分析;赵之寒:资料整理。