蓝莓中花青素的提取工艺研究

李艳秋，陈丹丹，贾 娟

（1.漯河职业技术学院食品学院，河南 漯河 462002；2.河南工业大学漯河工学院，河南 漯河 462002；3.河南豫蓝环保科技有限公司，河南 郑州 450001）

蓝莓（Vaccinium spp.）属于杜鹃花科越橘类，颗粒较小，外观类似于椭圆，果皮上有一层果霜，果肉软、嫩，酸甜适中，老人、小孩都可以食用，在水果中属于上品，有很高的营养价值，因而受到人们的欢迎[1]。蓝莓含有丰富的花青素，是常见果蔬中所含花青素比例最大的[2]。花青素属于类黄酮类，是一种水溶性天然色素，在植物中比较常见[3]。目前天然存在的花青素中常见的为天竺葵色素、飞燕草色素、锦葵色素、芍药色素、牵牛花色素、矢车菊色素。花青素在自然状态下主要以糖苷的形式存在，称为花色苷。花青素具有美容[4]、保护视力[5-6]、预防心血管疾病[7-9]、抗癌、抗糖尿病、抗肥胖、抗菌、预防慢性疾病[10]、抗抑郁、保护神经系统[11]、降低DNA 损伤、DNA 断裂和细胞内活性氧种类[12]、对睾丸有靶向作用[13]等功效，在食品着色、化妆品、染料、医药等方面应用广泛。

花青素的提取方法主要有溶剂提取法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法、酶辅助提取法等。微波辅助提取法设备昂贵，在溶剂的选择上有一定的局限性[14-15]；超声波辅助提取法对设备要求高[16]；酶辅助提取法提取成本较高，对温度要求比较严，对提取技术要求也很高[17]。溶剂提取法是提取花青素最常见的方法，操作简便，对设备要求不高，但存在安全隐患，有一定的毒副作用，提取时间长，提取率低，且含有杂质，溶剂消耗量大等[18]。本文以蓝莓为研究对象，利用对环境相对友好的柠檬酸乙醇混合溶液为提取剂，采用单因素试验和正交试验从蓝莓中提取花青素并优化其提取工艺，为花青素的提取提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

新鲜蓝莓，产地云南，放在-4 ℃冰箱里冷藏。

1.1.2 试剂

1.2 仪器与设备

飞利浦榨汁机，HR1876，飞利浦电子香港有限公司；紫外可见分光光度计，UV-2600，尤尼柯（上海）仪器有限公司；电子分析天平，FA2004 型，上海上平仪器有限公司；离心机，TGL-16G，上海安亭科学仪器厂；数显恒温水浴锅，HH-8，金坛市杰瑞尔电器有限公司；电热恒温干燥箱，202 型，北京市永光明医疗仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

将购买的蓝莓洗净，称取500 g 打匀成浆，放入冰箱中避光冷藏（-20 ℃），备用。

1.3.2 标准曲线的绘制

（1）0.8%盐酸-乙醇混合溶液的配制

移取2 mL 浓盐酸，用无水乙醇定容至250 mL。

（2）标准溶液的配制

总之，种子具有有性繁殖特点，基于对种子形态特征的分析，研究其与植被恢复、演替之间的关系。植被演替也给予种子的生产以及散布而形成，种子形态对植被的传播能力具有重要的影响。基于生物学、生态学角度分析种子特征对植被恢复造成的影响，阐述植被恢复演替的干扰性因素，对于促进植物学的发展具有重要意义。

准确称取矢车菊-3-O-葡萄糖苷标准品2.0 mg，置于10 mL 的棕色容量瓶中，用0.8%盐酸-乙醇混合溶液溶解后定容至刻度。

（3）系列标准使用溶液的配制

用移液管分别移取0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 mL 标准溶液于10 mL 棕色容量瓶中，用0.8%盐酸-乙醇混合溶液溶解后定容至刻度，浓度分别为4、8、16、24、32 μg/mL。

（4）标准曲线的测定

取系列标准溶液于比色皿中，以盐酸-乙醇混合溶液为空白，在520 nm 波长下测定吸光度。以矢车菊-3-O-葡萄糖苷的浓度为横坐标，相应的吸光度为纵坐标，绘制矢车菊-3-O-葡萄糖苷标准曲线，得到矢车菊-3-O-葡萄糖苷标准曲线的回归方程。标准曲线的回归方程为y=0.050 5x+0.034 2（R2=0.998 2）。

1.3.3 花青素的提取及提取量的计算

称取2 g（精确至0.000 1 g）的蓝莓果浆于锥形瓶中，按照设定的温度、提取剂的体积比、提取时间和料液比进行提取。提取结束后，用离心机进行离心取滤液，即为蓝莓花青素提取液。取适量上清液于比色皿中，以乙醇-柠檬酸混合溶液作为空白，在520 nm 波长下测定其吸光度。花青素提取量按照公式（1）计算。

式中，c 为根据标准曲线得到的吸光度下对应的花青素浓度，μg/mL；V 为样品和提取剂的总体积，mL；m 为所取蓝莓果浆的质量，g。

1.4 单因素试验设计

单因素试验的基础条件设为乙醇和柠檬酸的体积比6∶4，提取温度40 ℃，料液比为1∶20（g/mL），提取时间为90 min。提取温度设置为30、40、50、60、70 ℃，乙醇和柠檬酸体积比设置为3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3，提取时间设置为60、90、120、150、180 min，料液比设置为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL），以花青素的提取量为评价指标，进行单因素试验。

1.5 正交试验设计

根据单因素试验，选取对蓝莓花青素含量影响显著的主要因素，即提取温度、乙醇和柠檬酸的体积比、提取时间、料液比，按照四因素三水平进行正交试验设计，以蓝莓中花青素的提取量为指标，优化蓝莓花青素的提取工艺参数。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal test

2 结果分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 提取温度对蓝莓花青素提取量的影响

由图1 可知，当其他条件不变时，随着提取温度的升高，蓝莓花青素的提取量逐渐增加。当提取温度升高到40 ℃时，蓝莓花青素的提取量达到最大。而当提取温度继续升高时，蓝莓花青素的提取量开始降低。造成这一现象的原因可能是花青素对温度敏感，当温度升高时花青素不稳定，结构被破坏，导致花青素分解，最终使花青素的提取量降低。因此最佳提取温度为40 ℃。

图1 提取温度对花青素提取量的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of anthocyanin

2.1.2 乙醇和柠檬酸体积比对花青素提取量的影响

由图2 可知，当其他条件不变时，随着乙醇占比的升高，蓝莓花青素的提取量逐渐增加。当乙醇和柠檬酸的体积比为4∶6 时，蓝莓花青素的提取量达到最大。当乙醇占比继续升高时，蓝莓花青素的提取量开始降低。造成这一现象的原因可能是随着乙醇浓度的升高，溶剂的极性增大，当花青素与溶剂极性相近时，其花青素的提取量达到最大值，然后随着乙醇的浓度增加，其极性与花青素极性发生偏移，导致花青素的提取量降低，因此，最佳乙醇和柠檬酸的体积比为4∶6。

图2 乙醇和柠檬酸体积比对花青素提取量的影响Fig.2 Effect of volume ratio of ethanol and citric acid on the yield of anthocyanin

2.1.3 提取时间对蓝莓花青素提取量的影响

由图3 可知，当其他条件不变时，随着提取时间的延长，蓝莓花青素的提取量逐渐增加。当提取时间延长到150 min，此时蓝莓花青素的提取量达到最大。当提取时间继续延长时，蓝莓花青素的提取量开始降低。造成这一现象的原因可能是花青素被分解，最终导致花青素提取量降低。因此，最佳提取时间为150 min。

图3 提取时间对花青素提取量的影响Fig.3 Effect of extraction time on the yield of anthocyanin

2.1.4 料液比对蓝莓花青素提取量的影响

由图4 可知，当料液比增加到1∶20（g/mL），此时蓝莓花青素的提取量达到最大。当料液比继续增加时，蓝莓花青素的提取量开始降低。可能是因为，随着提取剂的体积增大，与蓝莓接触面积增大，更易于花青素的提取，但是，当料液达到饱和状态后，提取剂的增加会在一定程度上增大其他杂质的溶出，从而对花青素的提取效果造成影响，最终导致花青素提取量降低。因此，最佳料液比为1∶20（g/mL）。

图4 料液比对花青素提取量的影响Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the yield of anthocyanin

2.2 正交试验结果分析

由表2 可知，影响蓝莓花青素提取量的主次顺序为A（提取温度）＞C（提取时间）＞B（乙醇和柠檬酸体积比）＞D（料液比）。最优组合为A1B1C3D2，经验证试验该组合花青素的提取量为63.128 μg/g，均高于其他试验组。方差分析结果见表3。由表可以看出，提取温度（A）、乙醇和柠檬酸体积比（B）、提取时间（C）、料液比（D）这四个因素都影响蓝莓花青素提取量且影响都极显著。

表3 方差分析表Table 3 Table of variance analysis

3 结论

采用溶剂提取法，以乙醇柠檬酸混合溶液为提取剂，提取蓝莓中的花青素。试验得出最佳提取工艺参数为提取温度30 ℃，乙醇和柠檬酸的体积比3∶7，提取时间180 min，料液比1∶20（g/mL）。此时花青素的提取量为63.128 μg/g，溶剂提取法操作简便，虽然提取时间较长，溶剂消耗量较大，但是所选用的乙醇和柠檬酸溶液不会产生有害物质，与其它有机溶剂相比对环境友好，绿色环保。蓝莓花青素作为一种安全无毒的天然色素，在食品和化妆品方面应用前景广泛。相信随着提取方法的不断发展，蓝莓花青素在食品、化妆品等方面的应用会更加广泛。