低温等离子和1-甲基环丙烯调控糖酸代谢增强杏果对黑斑病的抗性研究

周丹丹,刘强,梁辉,李婷婷*

(1. 南京林业大学轻工与食品学院,南京 210037;2. 南京财经大学食品科学与工程学院,南京 210023)

杏果属于呼吸跃变型果实,采收主要集中在高温高湿的夏季,采后呼吸旺盛,易发生腐烂变质。杏果实皮薄且含水量高,极不耐贮藏,在贮运过程中易发生机械损伤造成微生物侵染,导致其货架期短[1]。研究表明,交链格孢菌(Alternariaalternata)是杏果实黑斑病的致病菌。A.alternata侵染的杏果实表皮会出现黑色或墨绿色霉状物,在适宜的温湿度下,A.alternata会迅速繁殖导致杏果发病,严重制约了杏果产业的发展[2-3]。

可溶性糖和有机酸是杏果实风味物质的重要组成成分。糖在杏果实生长发育和代谢过程中具有重要的作用[4]。柠檬酸和苹果酸是杏果中的主要有机酸,参与植物的呼吸作用,并参与合成蛋白质、脂类和香气物质等[5]。杏果实贮藏期间,呼吸作用逐渐增强,导致糖酸含量急剧下降,直接影响杏果实的品质,同时降低了其对外界微生物的抵抗作用[6]。

低温等离子体(CP)是一种新型冷杀菌技术,具有杀菌时间短、效果好,且无温度上升等特点[7]。CP处理产生多种活性粒子,能够杀死微生物和诱导果蔬产生抗性。研究表明,CP技术已广泛应用于蓝莓[8]、草莓[9]、猕猴桃[10]等果实保鲜处理。1-甲基环丙烯(1-MCP)是一种乙烯抑制剂,有抑制乙烯信号转导的作用,从而延缓果实衰老。利用1-MCP熏蒸处理可有效延缓呼吸跃变型果实的软化和品质裂变,延长果实的贮藏期和货架期,诱导果蔬产生抗性抵抗外界微生物的胁迫[11-14]。

笔者探究了CP和1-MCP技术对杏果采后黑斑病的调控作用,研究了CP和1-MCP技术对杏果采后可溶性糖和有机酸代谢的调控,通过构建糖酸代谢与果实抗病性的关联机制研究CP和1-MCP技术通过调控糖酸代谢增强杏果对黑斑病的抗性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

杏果实(品种金太阳),采自山西省农业科学研究院果树研究所。选取成熟期的杏果采摘后立即运回实验室,挑选大小一致、颜色均匀、无病虫害和机械损伤的果实作为实验对象,于4 ℃下预冷过夜。奎宁酸、莽草酸、苹果酸、柠檬酸、果糖、葡萄糖、蔗糖,购自上海源叶生物科技有限公司;乙腈(色谱纯),购自美国Sigma公司;磷酸二氢钾(分析纯),购自国药集团股份有限公司。其他试剂为国产分析纯。

1.2 孢子悬浮液制备

将A.alternata于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养7 d活化,向培养基中加入 10 mL无菌生理盐水,用三角玻璃棒刮下孢子,将收集的孢子悬浮液混合均匀,用无菌生理盐水调节浓度至 1×106CFU/mL。

1.3 杏果处理实验

A.alternata接种实验:杏果使用质量分数2%次氯酸钠消毒2 min,无菌水冲洗后自然晾干。用无菌钉在杏果赤道部位打取直径4 mm、深度3 mm的洞。对照组接入15 μL的无菌水;病害组接入15 μL的孢子悬浮液。将上述杏果晾干后置于塑料保鲜盒中在20 ℃、90%～95%恒温恒湿箱中贮藏6天,每天取样测定病害直径,并对杏果发病部位和健康部位交界处的果肉糖酸含量进行测定。

贮藏保鲜实验:杏果使用质量分数2%次氯酸钠消毒2 min,无菌水冲洗后自然晾干,置于1×106CFU/mLA.alternata孢子悬浮液中浸泡1 min后晾干备用。CP处理组:将杏果置于塑料保鲜盒中,在CPCS-I型介质阻挡放电低温等离子体设备(南京苏曼等离子科技有限公司)中处理60 s,处理电压为80 kV。1-MCP处理组:将杏果置于密封泡沫盒中,采用1 μL/L 1-MCP处理杏果24 h,处理结束后将杏果置于塑料保鲜盒中。对照(CK)组:杏果置于塑料保鲜盒中,不做任何处理。将上述处理后的杏果实于20 ℃,90%～95%恒温恒湿箱中贮藏 8天,每 2天取样进行品质指标、可溶性糖、有机酸和糖酸代谢酶活性的测定。

每组处理设置 3个平行,每个平行包含25个果实,所有实验均重复3次。

1.4 杏果品质测定

杏果品质测定选取CK组、CP组和1-MCP组的果实。

1)失重率:参考Guo等[14]的方法进行测定,单位为%。

2)腐烂率:烂果指果实表面至少有一处发生腐烂。腐烂率表示烂果的数量与总果实数量的百分比,单位为%。

3)硬度:采用XT plus TA质构仪(美国ISENSO)测定,采用P/2E探头(直径2 mm)。在果实赤道部位选取4个点去皮测定,单位为N。

4)颜色:采用CR-400型色差仪(日本Konica Minolta)测定果实表面的L、a、b值。其中,L值代表果实表面的明亮度,a值代表果实的红绿值,b值代表果实的黄蓝值。选取果实赤道部位进行测定。

5)总可溶性固形物(SSC)含量:采用PAL-1型数显折光仪(日本Atago)测定。每组选取10个果实的果肉混合进行测定,单位为%。

6)可滴定酸(TA)含量:采用PAL-Easy型酸度计(日本Atago)测定,结果以苹果酸质量分数表示,单位为%。

1.5 可溶性糖和有机酸含量测定

1)杏果实糖酸含量测定:参考Zhou等[15]的方法进行。

2)糖含量测定:采用1260型高效液相色谱(美国Agilent)测定,检测器为蒸发光散射检测器。色谱条件:碳水化合物柱(250 mm×4.6 mm×5 μm,长×内径×填料粒径),柱温40 ℃,流速1 mL/min,流动相为体积分数75%乙腈。

3)有机酸含量测定:采用e2695型高效液相色谱(美国Waters)测定,检测器为二极管阵列检测器。色谱条件:Atlantis T3柱(150 mm×4.6 mm×5 μm,长×内径×填料粒径),柱温40 ℃,流速0.6 mL/min,流动相为20 mmol/L KH2PO4(pH 2.5)。

1.6 糖代谢酶活性测定

1.6.1 糖代谢酶的提取

酸性转化酶(AI)、中性转化酶(NI)、蔗糖合酶(SS)和蔗糖磷酸合酶(SPS)的提取参考Yu等[16]的方法进行。提取液为Tris-HCl(pH 7.0),内含MgCl2、二硫代苏糖醇、乙二胺四乙酸二钠、乙二醇、牛血清蛋白和聚乙烯吡咯烷酮。AI反应液为醋酸钠缓冲液(pH 5.5)和蔗糖溶液;NI反应液为醋酸钠缓冲液(pH 7.5),内含MgCl2、乙二胺四乙酸和蔗糖;SS反应液为尿苷二磷酸葡萄糖、果糖、MgCl2和Tris-HCl(pH 7.0);SPS反应液为二磷酸尿苷葡糖、果糖-6-磷酸、MgCl2和Tris-HCl(pH 7.0)。

1.6.2 AI和NI活性测定

粗酶液分别与AI或NI反应液混匀,37 ℃水浴30 min后加入3,5-二硝基水杨酸试剂,沸水5 min冷却后于540 nm处测定吸光值。以每小时生成1 μmol葡萄糖的酶量为一个酶活性单位(U),AI和NI恬性的单位均为U/g。

1.6.3 SS和SPS活性测定

粗酶液分别加入SS或SPS反应液,混匀于37 ℃反应30 min,沸水5 min后终止反应,冷却至室温。上述体系中加入质量分数30%盐酸溶液,再加入0.1%间苯二酚溶液,于80 ℃水浴10 min后在480 nm下测得吸光值。以每小时催化1 μmol蔗糖生成的酶量为一个U,SS和SPS活性的单位均为U/g。

1.7 有机酸代谢酶活性测定

1.7.1 有机酸代谢酶的提取

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、柠檬酸合酶(CS)、细胞质乌头酸酶(cytACO)、线粒体乌头酸酶(mitACO)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-苹果酸酶(NADP-ME)的提取参考Zhou等[15]的方法进行。

1.7.2 有机酸代谢酶的活性测定

1)PEPC活性测定:粗酶液中加入pH 8.5 Tris-HCl、MgCl2、KHCO3、谷胱甘肽和磷酸烯醇式丙酮酸;充分混匀后在340 nm处测定吸光值,每10 s记录数据,以每分钟吸光值的变化为一个酶活性单位(U),单位为U/g。

2)CS活性测定:粗酶液中加入pH 9 Tris-HCl、5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)、乙酰辅酶A、草酸;混匀后在412 nm处测定吸光值,每10 s记录数据,以每分钟吸光值的变化为一个酶活性单位(U),单位为U/g。

3)cytACO和mitACO活性测定:分别取cytACO和mitACO酶液加入谷胱甘肽溶液于30 ℃环境中共培养1 h;随后加入pH 7.5 Tris-HCl、NaCl和乌头酸;混匀后在340 nm处测定吸光值,每10 s记录数据,以每分钟吸光值的变化为一个酶活性单位(U),单位均为U/g。

4)NADP-ME活性测定:取NADP-ME粗酶液加入pH 7.4 Tris-HCl、MnSO4、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和苹果酸充分混匀。上述体系于340 nm处测定吸光值,每10 s记录数据,以每分钟吸光值的变化为一个酶活性单位(U),单位为U/g。

5)NAD-MDH活性测定:粗酶液加入pH 8.2 Tris-HCl、KHCO3、MgCl2、谷胱甘肽、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和草酸混匀。上述体系于340 nm处测定吸光值,每10 s记录数据,以每分钟吸光值的变化定义为一个酶活性单位(U),单位为U/g。

1.8 数据分析

采用SAS 9.2中的Duncan多重比较法进行差异显著性分析,差异水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 杏果实病斑直径和糖酸含量的变化

随着贮藏时间的延长,对照组和接种组杏果实的病斑直径均呈现逐渐增大的趋势,对照组杏果实病斑直径小于接种组果实的病斑直径(表1)。贮藏至第6天时,接种组杏果的病斑直径高达15.54 mm,而对照组的杏果实病斑直径仅为6.96 mm。

表1 对照组和病害组杏果病斑直径和可溶性糖及有机酸含量的变化Table 1 Changes of disease diameter, soluble sugars and organic acids in control and diseased apricots

杏果实共检测到3种可溶性糖,分别为蔗糖、葡萄糖和果糖,其中蔗糖和葡萄糖的含量较高,这与Xi等[17]的研究结果一致。随着贮藏时间的延长,杏果实蔗糖含量呈现下降的趋势。接种A.alternata促进了杏果实蔗糖的降解,接种组杏果实蔗糖含量显著低于对照组。杏果实葡萄糖的含量呈现先上升后下降的趋势,葡萄糖的含量上升与蔗糖的降解密切相关。接种组杏果实葡萄糖含量较高,这与接种A.alternata促进了杏果实蔗糖降解有关。对照组果糖含量整体呈现先上升后下降的趋势,而接种组果糖含量整体呈现上升的趋势。综上所述,接种A.alternata通过分解蔗糖产生葡萄糖和果糖进而调控杏果实糖代谢。

共检测到4种有机酸,分别为苹果酸、柠檬酸、奎宁酸和莽草酸,其中苹果酸和柠檬酸含量较高,这与Xi等[17]的研究结果一致。苹果酸含量整体呈现先上升后下降的趋势。与对照组相比,接种A.alternata促进了苹果酸的降解,杏果贮藏至第6天时苹果酸含量仅为1.93 mg/g。随着贮藏时间的延长,柠檬酸呈现先上升后下降的趋势,接种A.alternata促进了杏果实柠檬酸的降解。奎宁酸、莽草酸含量较低,其中,奎宁酸含量呈现波动变化,莽草酸在贮藏过程中变化不显著。综上所述,接种A.alternata会促进果实有机酸的降解,主要是分解苹果酸和柠檬酸。

2.2 CP和1-MCP处理对杏果实病害和品质的影响

CK组、CP组和1-MCP组对杏果采后贮藏期间病害及品质的影响结果见表2。随着贮藏时间的延长,杏果病害发生率逐渐上升。CP和1-MCP处理显著抑制了杏果黑斑病的发病率,贮藏至第6天时,对照组杏果的发病率高达100%,而CP组发病率仅为32.33%。这主要与CP具有高效杀菌的特点密切相关。失重率随着贮藏时间的延长呈现上升的趋势,贮藏至第6天时,对照组失重率高达6.55%,与杏果发生严重的黑斑病密切相关。CP和1-MCP处理显著抑制了杏果实的失水。随着杏果实病害的加剧,果实的L值显著下降,CP和1-MCP处理均有效抑制了果实L值的下降。随着贮藏时间的延长,果实的a值呈现波动变化,CP和1-MCP处理对果实a值影响不显著。b值整体呈现下降的趋势,CP和1-MCP处理显著抑制了杏果实b值的下降。杏果实的硬度随着贮藏时间的延长呈现下降的趋势,果实硬度下降至0.55 N,1-MCP和CP处理均能显著抑制果实硬度的下降。TA含量随着贮藏时间的延长呈现整体下降的趋势,SSC含量呈现先上升后下降的趋势,CP和1-MCP处理均能延缓果实TA和SSC含量的下降。

表2 CP和1-MCP处理对杏果采后品质的影响Table 2 Effects of CP and 1-MCP on the changes of quality attributes in apricots

2.3 CP和1-MCP处理对杏果实可溶性糖含量的影响

CP和1-MCP处理对杏果实可溶性糖含量的影响见图1。随着贮藏时间的延长,蔗糖含量显著下降,从59.61 mg/g降至23.32 mg/g。CP和1-MCP处理显著抑制了蔗糖的降解。蔗糖与果实抗外界环境和微生物胁迫密切相关,CP和1-MCP通过抑制蔗糖的降解可以显著提高杏果对A.alternata的抵抗能力,进一步抑制了黑斑病的发病率。杏果实葡萄糖含量也较高,对照组和CP组杏果实的葡萄糖含量呈现先下降后上升随后下降的趋势,而1-MCP组葡萄糖含量呈现整体下降的趋势。处理组杏果葡萄糖的含量低于对照组葡萄糖含量,这与蔗糖的降解密切相关,对照组蔗糖降解迅速导致了葡萄糖的积累。杏果的果糖含量较低且整体呈现下降的趋势,1-MCP和CP处理对杏果实果糖含量影响较小。贮藏前期,1-MCP抑制蔗糖降解的效果较好,这主要与1-MCP具有延缓杏果实衰老的特性有关。贮藏后期,CP抑制蔗糖降解效果较好,主要与CP杀菌性能相关,通过杀菌抑制黑斑病的进程进而抑制蔗糖降解。

注:相同贮藏时间下,不同处理之间标有不同字母的有显著差异(P<0.05),下同。

2.4 CP和1-MCP处理对杏果实有机酸含量的影响

CP和1-MCP处理对杏果实有机酸含量的影响见图2。苹果酸含量呈现先上升后下降的趋势,CP和1-MCP处理均显著抑制了苹果酸的降解。柠檬酸含量整体呈现先上升后下降的趋势,CP和1-MCP处理均显著抑制了柠檬酸含量的降解。研究表明,苹果酸和柠檬酸是果实中的主要有机酸,也是植物三羧酸循环中的主要代谢物,参与了植物的呼吸代谢调控[5]。杏果实在遭受外界微生物胁迫后呼吸强度急剧上升,促进了三羧酸循环从而导致柠檬酸和苹果酸的降解。CP和1-MCP处理能够抑制杏果实黑斑病的发生,通过调控三羧酸循环从而抑制了柠檬酸和苹果酸的降解。杏果实中奎宁酸和莽草酸含量较低,在贮藏过程中,2种有机酸整体呈现波动的变化。与对照组相比,1-MCP处理在贮藏前期可以提高奎宁酸和莽草酸的含量,CP处理在贮藏后期可以抑制杏果奎宁酸和莽草酸的降解。1-MCP为乙烯受体抑制剂,具有抑制杏果成熟衰老的特性,而CP主要作用为杀菌,通过抑制果实的腐烂进而调控果蔬的成熟衰老。因此,1-MCP主要在贮藏前期和中期抑制果实有机酸的降解,而CP处理主要是在贮藏后期抑制有机酸的降解。

图2 CP或1-MCP处理对杏果实有机酸含量的影响Fig. 2 Effects of CP or 1-MCP treatments on the changes of organic acids

2.5 CP和1-MCP处理对杏果实糖代谢酶活性的影响

蔗糖是杏果中的主要糖组分之一,且蔗糖参与了植物的多种胁迫反应[18]。杏果实蔗糖代谢相关酶活性的变化结果见图3。AI和NI参与了蔗糖的降解反应,SS和SPS参与了蔗糖的合成反应。AI和NI活性整体呈现先上升后下降的趋势。贮藏前期和中期,CP和1-MCP处理显著抑制了AI和NI酶的活性,其中1-MCP抑制转化酶的效果更好,这与Liang等[19]的研究结果一致。研究表明,AI蛋白和基因的表达与果实抗逆境和微生物胁迫密切相关,AI所调控的蔗糖降解参与了果实采后抗逆境胁迫的调控进程[13,16]。SS的活性整体呈现先上升后下降的趋势,而SPS活性整体变化相对比较平稳。与对照组果实相比,CP和1-MCP处理组杏果实的SS活性较高,且处理组杏果实SPS活性贮藏第6天和第8天时均明显高于对照组。SS和SPS利用组织中的葡萄糖和果糖进一步合成蔗糖。与可溶性糖含量变化关联分析,CP或1-MCP处理显著抑制了蔗糖的降解,主要与处理组杏果较低的AI、NI酶活性以及较高的SS、SPS酶活性密切相关。

图3 CP或1-MCP处理对糖代谢酶活性的影响Fig. 3 Effects of CP or 1-MCP treatments on activities of enzymes in sugar metabolisms

2.6 CP和1-MCP处理对杏果实有机酸代谢酶活性的影响

苹果酸和柠檬酸是杏果实中的主要有机酸。PEPC和CS参与了杏果实柠檬酸的合成,而ACO参与柠檬酸的降解。杏果实PEPC活性随着贮藏时间的延长呈现显著下降的趋势,处理组杏果在贮藏第4天时PEPC活性显著高于对照组(图4)。杏果实CS活性呈现先上升后下降的趋势,贮藏中后期(6～8 d),CP和1-MCP处理显著抑制了CS活性的下降。cytACO活性随着贮藏时间的延长呈现下降的趋势,CP和1-MCP组杏果实cytACO活性显著低于对照组。mitACO活性随着贮藏时间的延长呈现先上升后下降的趋势,1-MCP和CP处理均能显著抑制mitACO活性。结合杏果采后柠檬酸含量的变化(图2b),CP和1-MCP处理通过提高PEPC和CS的活性,抑制cytACO和mitACO的活性进而抑制杏果实柠檬酸的降解。PEPC和NAD-MDH参与苹果酸的合成,而NADP-ME参与苹果酸的降解反应。随着贮藏时间的延长,NAD-MDH活性呈现先上升后下降的趋势。与对照组相比,1-MCP和CP显著提高了NAD-MDH的活性。NADP-ME活性整体呈现先上升后下降的趋势,对照组、CP组和1-MCP组的NADP-ME活性均在贮藏第4天达到最大值。CP和1-MCP处理均显著抑制了NADP-ME活性。结合杏果实贮藏期间苹果酸含量的变化(图2a),CP和1-MCP处理通过提高PEPC和NAD-MDH活性并抑制NADP-ME活性从而抑制杏果实苹果酸的降解。

图4 CP或1-MCP处理对有机酸代谢酶活性的影响Fig. 4 Effects of CP or 1-MCP treatments on activities of enzymes in organic acid metabolisms

3 结 论

本研究首先确定杏果黑斑病发病过程中会导致可溶性糖和有机酸含量的变化,并确定了采用1-甲基环丙烯(1-MCP)和低温等离子体(CP)处理可以有效抑制杏果实采后黑斑病的发病率、延缓果实软化和失水并维持较好的色泽。具体结论如下:

1)CP和1-MCP处理可以通过调控杏果实采后糖酸代谢影响果实的抗病性,这主要与CP和1-MCP处理延缓了蔗糖、柠檬酸和苹果酸的降解密切相关。

2)对于糖代谢,CP和1-MCP处理通过抑制酸性转化酶和中性转化酶的活性,并提高蔗糖合酶和蔗糖磷酸合酶的活性,从而抑制了杏果实蔗糖的降解。对于柠檬酸代谢,CP和1-MCP处理通过提高磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和柠檬酸合酶的活性,并抑制细胞质乌头酸酶和线粒体乌头酸酶的活性,进而抑制柠檬酸的降解。对于苹果酸代谢,CP和1-MCP处理提高了PEPC和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-苹果酸脱氢酶的活性,并抑制了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-苹果酸酶的活性,从而抑制苹果酸的降解。

综上所述,CP抑制杏果采后黑斑病主要与其杀菌性能及抑制杏果糖酸降解密切相关;1-MCP处理主要通过提高蔗糖、柠檬酸和苹果酸的含量提高了杏果实采后对黑斑病的抗性。