酸性木聚糖酶在玉米豆粕型日粮中的研究

2023-12-05黄志毅梁伟凡李阳源郭玉光

中国饲料 2023年22期

黄志毅，梁伟凡，李阳源，郭玉光

广东溢多利生物科技股份有限公司，广东珠海 519000

目前，木聚糖酶被广泛应用于饲料工业，其作用在于降低黏性，解除笼蔽效应等；目前应用的木聚糖酶最适pH 为7 左右，接近空肠中后段才能发挥最大的作用。酸性木聚糖酶在胃酸的条件下就能发挥作用，因此，在整个肠段相比中性木聚糖酶有更多的作用空间。利用定向突变等基因工程手段，筛选出了耐胃酸的木聚糖酶；本研究拟在玉米豆粕型日粮的基础上，以817 肉鸡为研究对象，添加酸性和中性木聚糖酶，以期得到酸性和中性木聚糖酶在使用上的区别，为饲料工业的应用提供更为广泛的选择性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验采用的中性木聚糖酶和酸性木聚糖酶由广东溢多利生物科技股份有限公司提供，活性均为10000 U/g。

木聚糖酶活力单位（U）定义：在37 ℃、pH 3.5 或者 5.5 条件下，每分钟从质量浓度为5 mg/mL 木聚糖溶液中，降解释放1 μmoL 还原糖所需要的酶量为1 个酶活力单位。

1.2 试验设计及饲粮组成

试验采用单因子随机设计，选取600 只1 日龄体重相近的健康817 肉公鸡，随机分为3 组，每组10 个重复，每个重复20 只鸡。对照组饲喂玉米– 豆粕型基础日粮，试验组分别在基础日粮中添加2000 U/kg 中性木聚糖酶或酸性木聚糖酶。试验期为42 d，分前期（1～21 d）和后期（22～42 d）两个阶段饲养。基础饲粮参考中国鸡饲养标准（NY/T 33–2004）配制，其基础饲粮组成及营养水平如表1 所示。

表1 基础饲粮配方以及营养水平(风干基础)

1.3 饲养管理

试验地点为珠海溢农生物科技有限公司，自由饮水，常规防疫和免疫，其余管理依照珠海溢农生物科技有限公司日常管理方式进行。

1.4 样品收集

试验结束后，每个重复取一只鸡，颈静脉采血，2000×g，离心20 min，收集血清，–20 ℃保存，待进一步分析。然后颈静脉放血致死，取回肠组织，将部分回肠组织剪碎，用10 倍体积（V/W）的4 ℃生理盐水稀释，在冰浴条件下匀浆，然后4 ℃条件下，4000 r/min 离心20 min，取上清分装保存于–80 ℃冰箱待测。

1.5 指标测定与方法

1.5.1 生长性能在试验的第21 天和42 天，对每个重复的鸡空腹称重，记录采食量，计算平均日采食量、平均日增重、料肉比和成活率。

1.5.2 养分表观消化率试验结束后，每个重复取一只鸡，采用全收粪法测定各营养物质消化率。干物质的测定采用高温干燥法（GB/T 9695.15–2008）；粗灰分的测定采用马福炉高温灼烧法（GB/T 9695.18–2008）；粗脂肪的测定采用索氏抽提法（GB/T 9695.1–2008）；粗蛋白质的测定采用凯氏半微量定氮法（GB/T 9695.11–2008）；钙的测定采用灰分法；磷的测定采用钒钼酸铵显色法；营养物质消化率计算公式如下：

某养分的表观消化率/%=[（某养分采食量–某养分排出量）/ 某养分采食量]×100。

1.5.3 血清生化指标按照试剂盒说明书测定肉鸡血清中总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、尿素氮、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）的含量，试剂盒均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.5.4 回肠抗氧化功能按照试剂盒说明书检测肉鸡回肠的总抗氧化能力（T-AOC）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性和丙二醛（MDA）的含量，试剂盒均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.5.5 实时荧光定量PCR取0.1 g 回肠组织于1.5 mL 无菌无RNase 离心管中，向其中加入1 mL Trizol（Sigma-Aldrich）后参照说明书进行总RNA 的提取；测定其浓度后取1 μg 总RNA参照PrimeScript reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）说明书进行反转录获得cDNA。根据NCBI 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中鸡β-actin 和ZO-1 的基因序列，利用PrimerBLAST 设计引物（表2），并交由上海生物工程有限公司进行合成。以cDNA 为模板，参照TAKARA TB Green Premix Ex Taq II（TaKaRa）说明书，在7500 Real Time PCR System 仪器上反应。以β-actin 作为本试验的内参基因，采用2–ΔΔCt 法计算ZO-1 mRNA 相对表达量。

表2 引物序列信息

1.6 数据分析

数据采用 SPSS 17.0 软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），并采用LSD 法进行多重比较。P＜0.01 视为差异极显著，P＜0.05 视为差异显著，结果均以“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 饲粮中添加酸性和中性木聚糖酶对肉鸡生长性能的影响

由表3 可知，在1～21 d，酸性木聚糖酶组ADG 分别比中性木聚糖酶组和对照组高2.87%（P＞0.05）和6.90%（P＜0.05）；中性木聚糖酶组ADFI 分别比酸性木聚糖酶组和对照组高0.55%（P＞0.05）和2.56%（P＜0.05）；F/G 方面，中性木聚糖酶组比对照组低0.03，酸性木聚糖酶组比对照组低0.07。在22～42 d，ADG、ADG和F/G 木聚糖酶组均比对照组好，但是差异不显著（P＞0.05）。从1～42 d 看，ADG 木聚糖酶组均比对照组高，但是差异不显著（P＞0.05）；酸性木聚糖酶组和中性木聚糖酶组F/G 分别比对照组低0.04 和0.03（P＞0.05）。

表3 酸性和中性木聚糖酶对肉鸡生长性能的影响

2.2 酸性和中性木聚糖酶对肉鸡营养物质消化率的影响

由表4 可知，酸性木聚糖酶组和中性木聚糖酶组干物质消化率分别比对照组高4.00%（P＜0.05）和4.47%（P＜0.05）；酸性木聚糖酶组和中性木聚糖酶组总能消化率分别比对照组高6.50%（P＜0.05）和6.96%（P＜0.05）；酸性木聚糖酶组和中性木聚糖酶组钙消化率分别比对照组高12.22%（P＜0.05）和9.53%（P＜0.05）；酸性木聚糖酶组磷消化率分别比中性木聚糖酶组和对照组高19.18%（P＜0.05）和33.88%（P＜0.05）。

表4 酸性和中性木聚糖酶对肉鸡营养物质消化率的影响 %

2.3 酸性和中性木聚糖酶对肉鸡血清生化指标的影响

由表5 可知，酸性木聚糖酶组GLB 含量分别比中性木聚糖酶组和对照组高1.31%和2.18%，但是差异不显著（P＞0.05）；酸性木聚糖酶组IgA含量分别比中性木聚糖酶组和对照组高17.25%（P＜0.05）和20.93%（P＜0.05）；中性木聚糖酶组IgG 含量分别比酸性木聚糖酶组和对照组高8.57%（P＞0.05）和38.54%（P＜0.05）；其他各指标无显著差异。

表5 酸性和中性木聚糖酶对肉鸡血清生化指标的影响

2.4 酸性和中性木聚糖酶对肉鸡回肠抗氧化能力的影响

由表6 可知，酸性木聚糖酶可显著提高回肠CAT 的水平（P＜0.05），很大程度提高了回肠和肝脏的GSH-Px 水平、降低回肠MDA 的水平。

表6 酸性和中性木聚糖酶对肉鸡回肠抗氧化能力的影响

2.5 酸性和中性木聚糖酶对肉鸡回肠紧密连接蛋白表达的影响

由图1 可知，与对照组相比，酸性木聚糖酶可显著提高回肠闭合小环蛋白–1（ZO-1）的mRNA相对表达量（P＜0.05）；中性木聚糖酶组在数值上有所提高，但差异不显著（P＞0.05）。

图1 酸性和中性木聚糖酶对肉鸡回肠ZO-1 mRNA相对表达量的影响

3 讨论

3.1 酸性和中性木聚糖酶对肉鸡生长性能的影响

目前，关于木聚糖酶的应用研究主要集中在小麦型基础饲粮上，而对玉米型基础饲粮研究较少（王鹏宇等，2010）。本试验研究发现，在玉米–豆粕型饲粮上，与对照组相比，饲粮中添加酸性木聚糖酶可显著提高1～21 日龄肉鸡ADG，料肉比在数值上有所降低，但差异不显著，这与Amerah 等（2017）在玉米–豆粕型饲粮基础上添加木聚糖酶改善1～21 日龄罗斯308 肉鸡生长性能的结果基本一致。原因可能在于木聚糖酶可降解饲粮中的水不溶性木聚糖，提高饲粮养分利用率（Gemma等，2017），改善肉鸡肠道健康（王剑等，2021；Zhang 等，2018），从而促进肉鸡ADG 的提高。在22～42 日龄，与对照组相比，木聚糖酶的添加对肉鸡生长性能无显著影响，这与徐叶桐等（2017）在小麦型基础饲粮的结果不一致，原因可能在于玉米型基础饲粮相比小麦型基础饲粮水溶性木聚糖含量较低，肠道食糜黏性不是主要的抗营养因素（王剑等，2021），且成年肉鸡相比于雏鸡消化系统发育完善，对非淀粉多糖耐受性提高，导致木聚糖酶在生长性能上无法体现出统计学差异。

3.2 酸性和中性木聚糖酶对肉鸡养分表观代谢率的影响

研究表明，木聚糖酶可提高饲粮的养分利用率（王雄等，2016；Vandeplas 等，2010），但对于不同类型饲粮营养消化率的改善其作用机制不同，小麦型饲粮营养消化率的改善主要得益于木聚糖酶对黏度效应的消除（Masey-O’Neill 等，2014），而对于玉米型饲粮中则更多是因为木聚糖酶对小肠内源性消化酶活性的提高（王鹏宇等，2010），并增加消化酶对细胞内容物的接触（王剑等，2021），从而改善饲粮养分表观消化率。Amerah 等（2017）研究表明，玉米–豆粕型饲粮中添加木聚糖酶可提高回肠表观消化能和淀粉、氮、总能的回肠表观消化率。Stefanello 等（2016）研究发现，添加木聚糖酶提高了玉米–豆粕型饲粮的粗蛋白质质和能量的表观消化率。本研究与上述结果基本一致，与对照组相比，添加中性木聚糖酶和酸性木聚糖酶显著提高了饲粮中干物质、能量、钙的表观消化率，磷表观消化率方面酸性木聚糖组显著高于对照组中性木聚糖酶组，原因在于酸性木聚糖酶具有耐酸的特性，在胃肠道中相比中性木聚糖酶拥有更长的作用时间和更大的作用空间，从而使得酸性木聚糖酶在提高饲粮表观消化率的效果更好。

3.3 酸性和中性木聚糖酶对肉鸡血清生化指标的影响

免疫球蛋白含量是评价家禽免疫功能的重要指标（唐青松等，2021）。吕秋凤等（2013）报道，在饲粮中添加1500 U/kg 未包被木聚糖酶可显著提高肉鸡血清IgG 的含量。本试验研究发现，与对照组相比，酸性木聚糖酶组肉鸡血清中IgA 含量显著提高，中性木聚糖酶组IgG 含量显著提高，这说明木聚糖酶的添加有利于增强肉鸡免疫功能。分析其原因，可能是因为木聚糖酶可以影响畜禽外周血激素水平，调控激素含量而增强机体免疫功能（韩世强等，2018）。另外，木聚糖酶可通过自身各种酶的协同作用将木聚糖水解为低聚木糖和木糖（李东红等，2018），从而提高肉鸡肠道中低聚木糖含量（Morgan 等，2020），而低聚木糖可提高家禽免疫功能（汪茫茫等，2019）。

3.4 酸性和中性木聚糖酶对肉鸡回肠抗氧化能力的影响

氧化应激会诱发氧自由基的过量产生，进而损伤生物大分子，最终导致肉鸡生长受阻。SOD、CAT 和GSH-Px 等抗氧化酶可通过清除氧自由基协助机体恢复氧化还原平衡，而MDA 含量的多少可作为机体脂质过氧化损伤程度的判断依据（王彬，2013）。尹晓楠等（2016）研究发现，饲粮中添加木聚糖酶能够显著提高肉鸡血浆的总抗氧化能力、总谷胱甘肽的含量和空肠黏膜的总抗氧化能力。本试验研究表明，酸性木聚糖酶组相比对照组和中性木聚糖酶组CAT 活性显著提高，GSH-Px 活性在数值上有所升高，MDA含量有所降低。原因可能在于木聚糖酶可通过自身各种酶的协同作用将木聚糖水解为低聚木糖和木糖（李东红等，2018），从而提高肉鸡肠道中低聚木糖含量（Morgan 等，2020），而低聚木糖可提高家禽抗氧化功能（周建民等，2021）。

3.5 酸性和中性木聚糖酶对肉鸡回肠紧密连接蛋白表达的影响

肠道紧密连接蛋白是构成肠道屏障功能的结构基础。Wang 等（2021）研究表明，在饲粮添加木聚糖酶和甘露聚糖酶可显著增加肉鸡空肠闭合蛋白– 1（Claudin-1）mRNA 相对表达量。郭双双（2016）研究表明，饲粮中添加木聚糖酶可显著增加肉鸡回肠的Claudin-1 mRNA 相对表达量。本试验与上述研究结果相似，与对照组相比，饲粮中添加酸性木聚糖酶可显著提高回肠中ZO-1 mRNA 相对表达量，中性木聚糖酶组在数值上也有所提高，但差异不显著。这说明在饲粮中添加酸性木聚糖酶有助于肠道紧密连接蛋白表达量的提高，原因可能在于木聚糖酶可提高肠道中乳酸杆菌的含量（Engberg 等，2004），而乳酸杆菌可通过激活肌球蛋白轻链磷酸化调节紧密连接蛋白的mRNA 表达（彭宇等，2020）。