棉籽浓缩蛋白替代发酵豆粕对仔猪生长性能、营养物质消化率、血液指标和粪便微生物代谢的影响

2023-12-05王仁杰宋孝明谢实勇赵金标

中国饲料 2023年22期

关键词：棉酚棉籽豆粕

王仁杰，宋孝明，谢实勇，赵金标，刘岭

1.中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193；

2.中农志远咨询管理有限公司，北京 100193；

3.成都大帝汉克生物科技有限公司，四川成都 611130；

4.北京市畜牧总站，北京 100125

我国是全球最大的饲料生产国和消费国，饲料原料中以大豆为代表的蛋白饲料原料存在进口依存度高且进口来源国集中的问题。国家海关总署数据显示，2020 年我国大豆进口量超1 亿吨，2021 年和2022 年进口量也都超过9000 万吨，占国内总消费量的85% 左右，占全球大豆贸易量的57% 左右，从巴西、美国、阿根廷三国进口大豆的数量占总进口量的97% 左右（于文静，2022 ；司伟，2022）。我国饲用豆粕主要来源于进口大豆压榨生产，每吨大豆可产豆粕约780 千克，国内大豆压榨企业每年豆粕产量为7000 多万吨，绝大部分进入了饲料生产（于文静，2022）。目前国内高蛋白饲料具有很大市场，在蛋白资源严重匮乏的同时，还存在着资源浪费及环境污染等问题。畜禽生产中大豆等蛋白饲料原料过度依赖进口与资源浪费并存以及养殖排泄物导致的环境污染严重已成为制约我国畜牧业可持续发展的主要瓶颈之一。

2021 年全国饲用棉籽及其加工产品资源量约为640 万吨，已用于饲料工业的棉籽加工副产品约为410 万吨，占资源量的64%。棉籽饼粕是传统的棉籽加工副产品，棉籽饼粕粗蛋白质含量与豆粕接近，但赖氨酸含量远远低于豆粕，而且蛋白质和氨基酸的消化利用效率仅为豆粕的70% 左右（康润，2017 ；马晓康，2015）。棉籽饼粕资源中游离棉酚较高且氨基酸平衡性较差严重限制了其在饲料工业生产中的应用潜力，目前我国每年约有200 万吨的棉籽以全籽或脱壳棉籽饼粕等形式在奶牛养殖等畜牧生产中使用。以棉籽粕为原料，在棉籽油萃取技术生产工艺的基础上，通过低温提油、脱酚等工艺生产出来的棉籽浓缩蛋白，可以极大程度地降低游离棉酚且提高粗蛋白质和氨基酸含量，其中精氨酸含量（约8%）远远高于豆粕（张铖铖等，2012）。

新生仔猪生长发育极为迅速，因此需要较多的营养物质，而仔猪的消化系统发育不成熟，消化酶活性比较低，对一些蛋白质利用效率低，因此，在仔猪生产过程中一般饲喂营养价值高且易消化的原料（Ingerslev 等，2021 ；Rafiee 等，2019）。发酵豆粕由于其均衡的氨基酸组成常常被用作仔猪教槽料和保育料中的植物性源蛋白质（王园等，2023；丁兵帅等，2022）。然而目前针对在保育料中使用棉籽浓缩蛋白替代发酵豆粕对仔猪生产性能的影响尚不清楚。因此，本研究在保育料中使用棉籽浓缩蛋白分别替代3%、6% 和9% 发酵豆粕探究其对仔猪生长性能、营养物质消化率、血液指标、粪便短链脂肪酸浓度和肠道微生物的影响，为仔猪饲粮中棉籽浓缩蛋白的使用提供基础数据和科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

棉籽浓缩蛋白由新疆某植物蛋白有限公司提供，该产品棉酚含量不超过500 mg/kg，且粗蛋白质含量不低于60%。

1.2 试验设计与试验动物

试验选取192 头杜× 长× 大三元杂交断奶两周的仔猪[（8.31±0.32）kg]，采用单因子试验设计，根据猪的体重、性别分为4 个处理，每个处理6 个重复，每个重复8 头猪。每个处理分别饲喂替代0%（对照组）、3%（试验1 组）、6%（试验2 组）和9%（试验3 组）发酵豆粕的4 种棉籽浓缩蛋白饲粮，调整日粮净能值和标准回肠可消化氨基酸含量相同。日粮配方见表1，日粮营养成分满足《中国猪营养需要》（2020）推荐的7～25 kg 生长猪对营养物质的需要量（中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，2020），日粮采用粉料饲喂，自由采食和饮水。试验期为28 d。

表1 试验日粮组成及营养水平（饲喂基础）

1.3 饲养管理

试验在国家饲料工程技术研究中心丰宁动物试验基地暨中国农业大学丰宁实验站（承德九运农牧有限公司）开展。采用全封闭式猪舍，试验前对猪舍进行彻底清洗消毒。试验期间舍内温度保持在24～28 ℃，湿度控制在60%～70%。试验仔猪分栏饲养于1.5×1.5×1.0 m3圈内，塑料漏缝地板，不锈钢料槽，鸭嘴式饮水器。试验期间保持猪舍通风和清洁，按常规管理程序进行驱虫和免疫，所有动物按照中国农业大学动物福利的相关标准执行。每天观察并记录仔猪采食和腹泻等健康状况。

1.4 检测指标及测定方法

1.4.1 仔猪生长性能及腹泻率在试验开始第14天和28 天分别空腹称量仔猪窝重及饲料重量，计算仔猪平均体重、平均日增重、平均日采食量和料重比。

试验期间每天08:00 和16:00 逐头检查仔猪，观察有无粪便污染及红肿并作好记录。粪便黏稠度评分等级为：1，固体坚硬粪便；2，略微松软粪便；3，部分成形的软便；4，半液体状粪便；5，液状、不成形，粪水有分离现象。发生腹泻的定义为粪便黏稠度评分连续2 d 在4 级或5级。腹泻率计算公式如下：

腹泻率/%=仔猪腹泻头次总和（/仔猪头数×试验天数）×100。

1.4.2 仔猪饲料养分消化率在试验的26～28 d 分别连续3 d 收集仔猪粪便，每天从每一圈中收集约100 g 新鲜粪样，于-20 ℃保存。粪样收集完成后，将3 d 的粪样均匀混合，在65 ℃烘箱中烘72 h，回潮24 h 后粉碎过40 目，装袋待测。

饲料和粪样中干物质（DM）、粗灰分（Ash）、粗脂肪（EE）、粗蛋白质（CP）和酸不溶灰分含量分别参照中华人民共和国国家标准GB/T 6435-2006、GB/T 6438-2007、GB/T6434-2006、GB/T 6432-2018 和GB/T 23742-2009 方法测定。总能（GE）按照国际标准ISO-9831:1998 方法，使用氧氮式热量计（1281 型，Parr 公司，美国）测定。养分消化率的测定采用指示剂法，饲料养分消化率计算公式如下：

饲料养分消化率/% = [1-( 饲料中酸不溶灰分含量× 粪中养分含量)/( 粪中酸不溶灰分含量×饲料中养分含量)]×100。

1.4.3 仔猪血清生化指标分析试验第28 天早上8 ∶00，每窝选取一头健康仔猪，空腹前腔静脉采血5 mL，静置3 h 后3000 r/min 离心15 min采集血清，于-20 ℃短期保存。

血液生化指标分析血清样品中白蛋白（ALB）、总蛋白（TP）、尿素（Urea）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（ AST）、碱性磷酸酶（ALP），免疫指标检测血清样品中免疫球蛋白A（IgA）、IgG、IgM、超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA），检测方法依据商品化试剂盒（南京建成生物工程研究所，南京，中国）的说明进行。

1.4.4 仔猪粪便短链脂肪酸（SCFA）含量分析试验第28 天，每窝中标记一头健康仔猪，通过肛门按摩的方法收集干净无污染的新鲜粪样20 g 左右，分为3～5 份，分别于-80 ℃保存，分析试验开始时，以窝为单位，将液氮中新鲜粪便于4 ℃解冻并混匀，无菌称取样品约1.5 g 于10 mL 离心管中，加超纯水至8 mL，将粪便充分打碎后超声20 min，随后在4 ℃条件下10000 r/min 离心15 min。取上清液用超纯水稀释100 倍，用注射器取1.5 mL 稀释液经0.22 mm 滤膜过滤至专用小瓶中，使用气相色谱仪（Ionpac AS11，美国）测定SCFA 含量。

1.4.5 仔猪粪便菌群结构分析使用DNA 试剂盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，USA）提取-80 ℃冷冻的仔猪粪便中细菌的总DNA，利用NanoDrop2000 检测DNA 浓度和纯度。根据细菌通用引物515F（5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’）和907R（5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’）对细菌V4～V5 可变区的16S rRNA 基因进行PCR 扩增。根据97% 的相似度对序列进行操作分类单位（OTU）聚类，并使用Userach 鉴定和移除嵌合体序列。每个OTU 都有一个代表性的序列，使用RDP 数据库，置信度阈值设置为0.8，利用RDPClassifer 将每个代表性序列进行物种注释。OTU profiling table 和alpha 多样性分析通过Qiime 的python 脚本实现。

1.5 统计方法

试验数据采用SAS 9.2 统计软件中GLM 模型以ANOVA 方法进行分析，生长性能和腹泻率数据以窝为试验单位，其他数据以仔猪个体为试验单位。若各个处理间差异显著，则用Duncan's法多重比较进行检验。结果用最小二乘法的均值和均值标准误表示，P≤ 0.05 时为差异显著，0.05＜P≤ 0.10 时为趋于显著。

2 结果

2.1 棉籽浓缩蛋白替代发酵豆粕对仔猪生长性能与腹泻率的影响

由表2 可知，各组仔猪之间14 d 体重和28 d体重均没有显著差异（P＞0.05）；试验前期、后期和全期四个处理之间仔猪日增重、采食量没有显著差异（P＞0.05）；试验前期和试验后期6%替代组仔猪料重比与其他三组相比有降低的趋势（0.05＜P＜0.10）；试验全期6% 替代组仔猪显著低于对照组和3% 替代组（P＜0.05），9% 替代组仔猪料重比显著低于对照组（P＜0.05）；四个处理之间仔猪在试验前期、后期和全期的腹泻率没有显著差异（P＞0.05）。

表2 棉籽浓缩蛋白替代发酵豆粕对仔猪生长性能和腹泻率的影响

2.2 棉籽浓缩蛋白替代发酵豆粕对饲料养分消化率的影响

由表3 可知，四个处理组之间仔猪对饲料DM、GE 和NDF 的消化率没有显著差异（P＞0.05）；9% 替代组仔猪对饲料CP 的消化率显著高于其他三个处理组（P＜0.05），其他3 个处理之间没有显著差异（P＞0.05）；四个组间仔猪对饲料粗灰分消化率没有显著差异（P＞0.05）；9% 替代组仔猪对饲料中EE 的消化率显著高于对照组和3% 替代组（P＜0.05）；9%替代组仔猪对饲料中ADF 对的消化率显著高于对照组（P＜0.05）。

表3 棉籽浓缩蛋白替代发酵豆粕对仔猪饲料养分消化率的影响 %

2.3 棉籽浓缩蛋白替代发酵豆粕对仔猪血液生化、抗氧化与免疫指标的影响

由表4 可知，四个处理组仔猪血清中总蛋白、白蛋白、尿素含量和IgA 含量，血清中AST和ALP 活性没有显著差异（P＞0.05）。对照组仔猪血清ALT 活性有高于3% 替代组的趋势（0.05＜P＜0.10）；6% 替代组仔猪血清SOD、GSH-Px 和T-AOC 的活性显著高于其他三个处理组（P＜0.05），3% 替代组仔猪血清SOD 和GSH-Px 的活性显著高于对照组和9% 替代组（P＜0.05），对照组仔猪血清T-AOC 的活性显著高于9% 替代组（P＜0.05）；6% 替代组仔猪血清MDA 含量显著低于对照组和9% 替代组（P＜0.05），对照组和3% 替代组仔猪血清MDA含量显著低于9% 替代组（P＜0.05）；6% 替代组仔猪IgG 含量显著高于对照组和9% 替代组（P＜0.05），6% 替代组仔猪IgM 含量显著高于9% 替代组（P＜0.05）。

表4 棉籽浓缩蛋白替代发酵豆粕对仔猪血液生化、抗氧化与免疫指标的影响

2.4 棉籽浓缩蛋白替代发酵豆粕对仔猪粪便短链脂肪酸含量的影响

由表5 可知，4 个处理组仔猪粪便中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸和总挥发性脂肪酸的含量没有显著差异（P＞0.05）。

表5 棉籽浓缩蛋白替代发酵豆粕对仔猪粪便短链脂肪酸含量的影响mg/kg

2.5 棉籽浓缩蛋白替代发酵豆粕对仔猪粪中微生物菌群的影响

2.5.1 α 多样性分析仔猪粪便微生物α 多样性分析见表6。结果表明，各组操作分类单元序列的覆盖率均达到0.99 以上，说明得到的OUT序列对于试验结果具有代表性。其中3%替代组Shannon 指数显著有高于对其余4 组的趋势（0.05＜P＜0.10）；四个处理组之间Simpson 指数，Ace 指数和Chao 指数没有显著差异（P＞0.05）。

表6 棉籽浓缩蛋白替代发酵豆粕对仔猪粪便微生物α 多样性的影响

2.5.2 仔猪粪中门水平下微生物群结构仔猪粪中门水平微生物菌群结构见表7。结果表明，仔猪粪便样本中，相对丰度大于0.1% 的门共有6 个，分别是厚壁菌门（ Firmicutes）、拟杆菌门（ Bacteroidetes）、螺旋体门（ Spirochaetes）、放线菌门（ Actinobacteria）、蓝细菌门（Cyanobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）。结果显示，9% 替代组放线菌门显著低于其他三个处理组（P＜0.05）；9% 替代组后壁菌门的相对丰度较低，拟杆菌门相对丰度较高，但各组之间没有显著差异（P＞0.05）。

表7 仔猪粪便微生物主要菌群门水平上的相对丰度

2.5.3 仔猪粪中属水平下微生物群结构仔猪粪中门水平微生物菌群结构见表8。结果表明，仔猪粪便样本中，相对丰度大于1%的属共有18 个，本试验仔猪粪便样品中，乳杆菌属（Lactobacillus）明显是优势菌属，且9%替代组仔猪粪便中乳杆菌属丰度比其他3 个处理组低，但各处理组之间乳杆菌属丰度没有显著差异（P＞0.05），其余属水平17 个相对丰度大于1%微生物在各处理组之间也没有显著差异（P＞0.05）。

表8 仔猪粪便微生物主要菌群属水平上的相对丰度

3 讨论

棉籽的传统加工工艺主要有压榨法、直接浸提法和预压浸提法，棉籽粕是棉籽脱壳后，然后通过机械或者溶剂提油后的产品，其中包括棉仁、纤维和剩余油脂部分。经过传统加工工艺生产出的棉籽粕中含有较多的棉酚、环丙烯脂肪酸和单宁等抗营养因子，其中棉酚含量较高是限制棉籽粕在养殖业中广泛使用的主要原因之一。棉酚是棉籽中的主要的抗营养因子，使用传统工艺加工技术是无法解决棉籽脱酚、脱毒等问题（孙宏等，2013）。棉酚的毒性主要是游离棉酚中的活性醛基和羟基引起（Lordelo 等，2006；Meno 等，2004）。棉酚是细胞、血管和神经性毒物，能够导致许多浆液浸润和出血炎症，对心、肝、脾等细胞及神经、血管、生殖机能均有毒性，使动物实质器官病变、坏死，消化机能紊乱。另外，棉籽粕中游离棉酚在高温挤压过程中容易发生美拉德反应，与赖氨酸结合后形成不溶性复合物，从而降低赖氨酸消化率（Skutches 等，1974）。

棉籽通过有机溶剂浸出棉籽油，提取油后的棉籽粕再采用丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇等极性溶液萃取脱除棉酚，进而制得棉籽浓缩蛋白。棉籽浓缩蛋白和棉籽饼粕最大的区别是棉籽饼粕通过蒸炒和高温压榨降低游离棉酚的含量，但棉酚含量降低的程度较小，而且蒸炒的过程会使蛋白质热变性，从而降低其消化率。棉籽浓缩蛋白通过甲醇萃取降低游离棉酚的含量，不仅能最大限度的降低游离棉酚，同时低温工艺还能最大限度地保留了棉籽蛋白的消化率。

豆粕是我国畜禽生产最常用的饲料原料，具有氨基酸组成平衡、蛋白质消化率高等特点。棉籽饼粕作为常见的豆粕替代原料之一，由于棉酚含量较高限制了其在畜牧业中广泛使用。而棉籽饼粕经过脱酚加工技术处理后得到的棉籽浓缩蛋白，具有蛋白质含量高、游离棉酚含量低等特点。前期，很多研究学者利用棉籽浓缩蛋白替代生长育肥猪饲粮中的豆粕，探究其对猪生长性能和营养物质消化率的影响。已有研究表明棉籽浓缩蛋白分别替代生长猪饲粮中0%、50%、75% 和100% 的豆粕，结果表明棉籽浓缩蛋白不同替代处理对猪的生长性能、血液指标和肉品质均无显著影响（李敏，2012 ；周维仁和刘福春，2007）。刘昌娥等（2019）研究表明，日粮中添加棉籽浓缩蛋白对生长猪的血生化、蛋白质代谢和健康状况无负面影响。综上所述，生长育肥猪饲粮中添加适量棉籽浓缩蛋白替代豆粕对于猪生产性能无不良影响。

乳仔猪和断奶仔猪免疫和消化系统发育不成熟，需要提供蛋白质消化率高、适口性好的饲粮，由于对于游离棉酚的耐受性较差，因此棉籽浓缩蛋白在仔猪上的研究较少。本研究团队前期以断奶仔猪作为研究对象，在保证饲粮净能和标准回肠可消化氨基酸含量一致的条件下，结果表明与大豆浓缩蛋白组相比，使用棉籽浓缩蛋白替代不同添加比例的大豆浓缩蛋白对断奶仔猪的生长性能、营养物质消化率、血生化、血清免疫和抗氧化指标均无显著影响（赵金标等，2023）。李敏（2012）用棉籽浓缩蛋白分别替代饲粮0%、20%、40%、60% 的豆粕，结果表明各替代组的断奶仔猪生长性能和血液生化指标均无显著差异。Wang 等（2019）和赵建飞（2021）报道，使用棉籽浓缩蛋白等比例替代大豆浓缩蛋白或者鱼粉后对断奶仔猪生长性能、腹泻率和营养物质消化率以及血生化与免疫指标均无显著影响。与上述结果相似，本试验中仔猪饲料中使用棉籽浓缩蛋白替代部分或者全部发酵豆粕对仔猪生长性能无显著影响，而且能改善仔猪饲料转化效率和饲料中营养物质消化率，说明在仔猪饲料中可以用棉籽浓缩蛋白替代发酵豆粕。

饮食、肠道健康与肠道微生物之间的相互作用越来越备受关注，因为肠道微生物群能为宿主提供许多益处，如塑造肠上皮细胞或增强肠道完整性（Natividad 等，2013）。有研究表明断奶仔猪饲粮中添加适量棉籽浓缩蛋白可以改善仔猪肠道微生物组成和上皮屏障功能（Li 等，2019 ；Li 等，2019）。α- 多样性被用作肠道微生物群生态系统功能恢复力的指标，包括物种多样性（Shannon）和丰富度（Chao）（Zhang 等，2020）。在本研究中，使用棉籽浓缩蛋白替代发酵豆粕微生物群的物种多样性无显著影响。厚壁菌门和拟杆菌门被发现是断奶仔猪门水平上的主要细菌群落，约占断奶仔猪肠道样本总基因序列的95%（Zhao 等，2018）。本研究的主要菌门组成与前人的报告相似，但随着棉籽浓缩蛋白替代水平增加，放线菌门的丰度逐渐降低。另有研究表明植物的膳食纤维会使乳酸菌属选择性增殖（Marotti 等，2012），随着乳酸杆菌属在肠道微生物中越来越占主导地位，微生物群之间的竞争变得更加激烈，导致其他微生物群普遍减少。具体而言，乳酸杆菌属的增殖会产生更多的乳酸并降低pH，其他细菌的pH 耐受性也会影响其组成（Yu 等，2020）。与此相似，本研究中，乳杆菌属明显是优势菌属，且9% 替代组仔猪粪便中乳杆菌属丰度比其他3 个处理组偏低，但各处理组之间乳杆菌属丰度没有显著差异，其余属水平17个相对丰度大于1%微生物在各处理组之间也没有显著差异。

本研究仔猪饲料中使用棉籽浓缩蛋白替代发酵豆粕对仔猪生长性能、营养物质消化率、血液指标、粪便短链脂肪酸浓度和微生物多样性均无负面作用，这表明棉籽浓缩蛋白可以在仔猪饲料中替代发酵豆粕。