陕西省野生拟黑虫草的多基因分子生物学鉴定

孟桂花,李孟楼,王春燕

(西北农林科技大学 林学院,陕西杨凌 712100)

虫草是虫生真菌寄生于昆虫虫体后形成的菌虫复合体,包括寄生真菌和寄主昆虫两部分。长期以来,人们习惯将虫生真菌、虫生真菌与其寄主形成的复合体均称为虫草,而未将二者区分开,造成了名称使用上的混乱,易引起非专业人员的混淆。为此,Zhang等[1]提出了新的术语规则:在仅指形成虫草的虫生真菌时使用虫草菌、冬虫夏草菌等名称,而涉及到虫生真菌与寄主形成的复合体时使用虫草、冬虫夏草等名称,由此避免名称混淆。虫草菌是广义虫草属(Cordycepss. l.)所有真菌的统称,作为昆虫病原真菌,可被开发成生防菌剂,在害虫生物防治领域发挥着重要作用[2]。虫草菌隶属于子囊菌门(Ascomycota),是子囊菌中多样性较高的类群之一,全世界已报道的虫草菌有近千种[3],中国已报道的虫草菌约120种[4]。虫草菌不仅种类繁多,其寄主种类也比较复杂,不同虫草菌侵染的昆虫种类及范围不同,因此仅依靠传统的形态学很难对虫草种类进行准确的分类鉴定。近年来,分子生物学技术在虫草菌物种鉴定及其与相关属真菌之间亲缘关系的认定中发挥了重要作用[2],极大提升了虫草物种分类鉴定的效率和准确性。

在分子生物学鉴定过程中,由于绝大多数单基因系统进化树在某些关键节点上的支持率较低、聚类可信度不高,因而仅依靠单基因进行物种的分类鉴定存在一定的局限性[4]。多基因涵盖的信息比单基因多,通过联合多个DNA片段构建的多基因系统进化树能更可靠地反映物种之间真正的系统发育关系[5-6],也能明显提高进化树的分辨率和可信度[7]。如今,多基因联合分析也被广泛地用于虫草菌分类地位的鉴定中[8-9]。Sung等[10]利用核糖体大亚基LSU和小亚基SSU、RNA聚合酶Ⅱ大亚基RPB1和小亚基RPB1及EF-1α等多个基因位点对虫草类真菌进行了系统分类,将广义的虫草属重新分成了4个属:狭义虫草属(Cordycepss. s.)、鹿虫草属(Elaphocordyceps)、异虫草属(Metacordyceps)和线虫草属(Ophiocordyceps),该分类系统被学术界广泛认可和接受。

张兴民等[11]根据虫草子座及虫体形态,将陕西省旬邑县石门山林区采集到的野生虫草初步鉴定为山西省报道过的香棒虫草(O.barnesii),但该林区虫草的产量比山西的香棒虫草大,且发现的寄主昆虫仅小阔胫绒金龟(Maladeraovatula)1种,而已报道的香棒虫草的寄主种类比较复杂,因此该虫草是否为香棒虫草需进一步验证。本研究在形态学观察的基础上,通过多基因序列分析和系统进化树的构建,以Wang等[12]建立的多基因系统进化树为佐证,明确石门山林区虫草的种类及其虫草菌的分类地位,以期丰富陕西省的虫草真菌资源,为陕西省虫草资源的保护和可持续利用提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 标本采集

野生虫草标本采集自陕西省旬邑县石门山林区。刮去采集的虫草表面土壤后用报纸包裹放入灭菌的塑封袋中,置于4 ℃冰箱内保存备用。

1.2 形态观察

测量虫草子实体及虫体的长度和直径,用体视显微镜观察虫草子实体的着生位置、子实体顶部和虫体的形态,拍照并记录相关数据。

1.3 分子生物学鉴定

1.3.1 DNA提取

在超净工作台内,使用无菌手术剪将虫草子实体和虫体分别剪成长5 mm的小段置于培养皿中,依次用升汞水溶液浸泡30 s,75%酒精浸泡3 min,无菌水清洗4～5次。用无菌滤纸吸干样品表面的水后将其放入无菌研钵中,加入液氮研磨成粉末。最后,用CTAB法[13]提取DNA作为后续基因扩增的模板。

1.3.2 目的基因扩增及测序

使用3对引物(ITS1和ITS4[14]、983F和2218R[15]、CRPB1和RPB1Cr[16],由上海生物工程技术公司合成)对虫草菌DY6F的3个DNA序列位点(ITS、EF-1α和RPB1)分别进行扩增,扩增体系参照仇飞[17]的方法。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后于紫外透射下观察PCR条带,检测合格后送至陕西杨凌天润奥科生物公司进行双端测序。

1.3.3 序列比对和系统进化树的构建

将测序所得的基因序列在NCBI数据库中进行BLAST比对,并从GenBank中分别下载同源性较高的ITS、EF-1α和RPB1基因序列,用ClustalW进行基因序列的比对,序列两端截齐后使用Mega7.0构建单基因Neighbor-Joining(NJ)系统进化树,进化树各分支上的数值为经1 000次Bootstrap后的置信度。利用PhyloSuite v1.2.2(http://phylosuite.jushengwu.com/)软件将EF-1α和RPB1的基因序列串联成数据集,通过ModelFinder计算这2个基因序列的最佳模型,并用Mr-Bayes的贝叶斯推理法(Bayesian Intreence,BI)构建多基因系统进化树,通过节点上的后验概率值(Bayesian posterior probability,BP)评估构建的进化树,最后用Chiplot网站(https://www.chiplot.online/tvbot.html)进行系统进化树的美化[18]。

2 结果与分析

2.1 形态观察

虫草子实体从寄主昆虫幼虫头部的下侧方长出,单生,无分支,棍棒状(图1,A),顶部呈圆形或钝头状(图1,B),长度为3～6.2 cm,直径为0.1～0.2 cm;新鲜时为黄褐色,晒干后呈棕褐色,品相较差。寄主为金龟子幼虫(又称蛴螬),虫体粗而肥,黄色,呈直线型或C型弯曲,长度为1.2～1.9 cm,直径0.2～0.6 cm(图1,C)。

A.虫草子实体形态;B.虫草子实体顶部;C.寄主。图1 虫草标本的形态特征A. Morphological characteristics of fruiting body;B. Top of fruiting body; C. Host.Fig.1 Morphological characteristics of cordyceps

2.2 序列比对及系统进化分析

2.2.1 基因测序结果与序列比对

研究获得虫草菌DY6F的ITS、EF-1α和RPB1基因片段的长度分别为576,921,732 bp,将所得序列提交至GenBank,获取登录号分别为OQ711778、OQ828437、OQ828436。NCBI在线Blast比对的结果显示,这3个基因的序列与拟黑虫草菌(O.nigrella)相应基因序列的相似度最高(99%～100%),而与线虫草属(Ophiocordyceps)其他种相应基因序列的相似度只在80%～90%之间。由此可见,虫草菌DY6F与拟黑虫草菌的亲缘关系最近。

2.2.2 单基因系统进化分析

基于所获得的虫草菌DY6F的3个基因片段的序列,以及下载的相似度较高的其他物种的基因序列,分别构建了ITS(图2)、EF-1α(图3)和RPB1(图4)单基因NJ系统进化树。这3个进化树的拓扑结构基本一致,虫草菌DY6F与拟黑虫草菌聚集于同一个分支,支持率达到100%,表明虫草菌DY6F与拟黑虫草菌的遗传距离最近。但基于ITS和RPB1基因序列构建的单基因NJ系统进化树中,不同种的很多上级分支节点的支持率都低于60%,聚类可信度相对较低。

图2 基于ITS序列构建的NJ系统进化树Fig.2 NJ phylogenetic tree based on ITS sequences

图3 基于EF-1α序列构建的NJ系统进化树Fig.3 NJ phylogenetic tree based on EF-1α sequences

图4 基于RPB1序列构建的NJ系统进化树Fig.4 NJ phylogenetic tree based on RPB1 sequences

2.2.3 多基因联合系统进化分析

通过ModelFinder计算出的EF-1α和RPB1基因数据分区的最佳模型为GTR+G+I,它们的串联序列数据集由1 641个碱基组成,其中GC含量为56.7%,AT含量为43.3%。所构建的多基因系统进化树各分支的支持率较高,除3个分支节点外,支持率均超过95%;不同种上级分支节点的支持率也比单基因系统进化树中同一节点的支持率高,线虫草属内同种不同菌株均能聚集于同一分支,且支持率均为100%(图5)。这表明,所构建的多基因系统进化树的聚类结果较为可信。

图5 基于EF-1α和RPB1序列联合矩阵构建的BI系统进化树Fig.5 BI phylogenetic tree inferred from combined EF-1α and RPB1 sequences

多基因系统进化树大致可分为3个不同的系统进化支,分别为Hirsutella进化支、O.sobolifera进化支和O.ravenelii进化支;在O.ravenelii进化支的亚分支ravenelii-scarabaeidae中,O.highlandensis、O.konnoana和O.barnesii形成1个姐妹群,O.ravenelii、O.superficialis和拟黑虫草菌形成1个姐妹群,而虫草菌DY6F与拟黑虫草菌聚于同一分支,支持率为100%(图5)。综上所述,虫草菌DY6F被鉴定为拟黑虫草菌,石门山林区发现的野生虫草为拟黑虫草,这是陕西省境内发现的又一种新的虫草资源。

3 讨 论

多基因联合分析能突破单基因分析的局限,可以更准确地反映菌株间的亲缘关系及分类地位。本研究基于虫草菌DY6F的ITS、EF-1α和RPB1基因序列分别构建了单基因及多基因联合系统进化树,最终将陕西省旬邑县石门山林区的虫草菌DY6F鉴定为拟黑虫草菌,野生虫草鉴定为拟黑虫草。拟黑虫草是拟黑虫草菌寄生于金龟子幼虫后形成的菌虫复合体,拟黑虫草菌是广义虫草属的一种,隶属子囊菌门(Ascomycota)、粪壳菌纲(Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、线虫草科(Ophiocordycipitaceae)、线虫草属(Ophiocordyceps)[10]。国内外关于拟黑虫草的研究相对较少,日本曾报道过拟黑虫草的生长环境和宏观形态特征[19],国内有学者对山西境内采集到的拟黑虫草的遗传多样性及其区系真菌多样性进行了研究[20-21]。本研究首次在陕西省发现了拟黑虫草,增加了拟黑虫草在中国的分布地区,为拟黑虫草这一珍稀虫草资源的利用提供了基础。

陕西省境内发现的植物新类群较多[22-24],而关于虫草的报道相对较少,目前已发现的虫草种类有变形虫草(O.variabilis)、布氏虫草(C.brongniartii)[25]及秦巴蛹虫草(C.militaris)[26]等,主要分布于秦岭地区。本研究鉴定所得的拟黑虫草是陕西省新发现的一种虫草资源。张兴民等[11]调查发现,旬邑县药商从2016年起就开始大量收购拟黑虫草(曾被鉴定为香棒虫草),每1 kg价格在600元以上,表明拟黑虫草具有很高的药用价值和市场前景。但目前关于拟黑虫草生物学及化学药理成分的研究很少,无法明确其质量、药用功能及作用,阻碍了拟黑虫草的开发利用。野生冬虫夏草资源极度缺乏,国内外学者长期致力于冬虫夏草的人工培养及其替代品的研究。培育近缘种作为冬虫夏草替代品具有最大的优势[27-28],拟黑虫草与冬虫夏草同科同属,亲缘关系较近,具有冬虫夏草替代品的潜能,本研究未分离培养出拟黑虫草无性型。因此,后续需加强拟黑虫草的生物学特性及人工培育技术研究,深入考察拟黑虫草的药效,揭示其药用价值,明确其被开发成冬虫夏草替代品进行产业化生产的可行性和市场前景,并建立科学合理的保护和可持续利用机制。