SPD-RF检测器联用检测葡萄酒及黄酒中氨基酸的分析方法研究

王英年

摘要：文中采用在线衍生和二极管阵列-荧光检测器串联分析对葡萄酒和黄酒中的17种氨基酸含量进行测定，回收率及方法线性关系良好。通过不同检测波长将一级、二级氨基酸分离，并通过自动进样器的程序设定解决手工操作繁琐及手工衍生的偏差。采用内标法能有效提高定性的可靠性和定量的准确性。对葡萄酒和黄酒的同步检测，可缩短检测时间和成本。

关键词：氨基酸；在线衍生；检测器串联

Determination of Amino Acids in Wine and Yellow Rice Wine by PDA Coupled with RF Detector

WANG Yingnian

（ Longyan Product Quality Inspection Institute， Longyan 364000， Fujian， China ）

Abstract： The content of 17 amino acids in wine and yellow rice wine was determined by on-line derivatization and diode array-fluorescence detector tandem analysis. The first and second amino acids were separated by different detection wavelengths， and manual operation and deviation were solved by automatic sampler. Using internal standard method can effectively improve the reliability of qualitative and quantitative accuracy. The simultaneous detection of wine and rice wine can shorten the detection time and cost.

Key Words：  Amino acid; On-line derivative; Detector tandem

0 前言

氨基酸是構成人体蛋白质的最基本物质，在人体内通过代谢发挥着重要作用，与生命活动息息相关。葡萄酒和黄酒中含有的丰富氨基酸，是两类酒的风味物质组成，它易于被人体吸收及消化，因此，适量饮用葡萄酒和黄酒有益身体健康。目前，检测葡萄酒行业检测标准方法采用荧光检测法，黄酒行业检测标准方法采用二极管阵列或紫外检测器。而在日常检测工作中，手工操作繁琐，很难将一级氨基酸（C-NH2）和二级氨基酸（羟脯氨基酸）分离。笔者通过对自动进样器进行程序设定，采用OPA（邻苯二四醛）和FMOC（9-芴基甲基氯甲酯）[1]柱前衍生试剂让自动进样器吸取衍生试剂，让氨基酸在定量环内充分反应，梯度洗脱，再进入色谱柱分离，通过多波长检测通道对多种氨基酸进行检测。笔者采用二极管阵列（PDA）检测器串联荧光（RF）检测器方法[2]同时对这两类酒的17种游离氨基酸含量进行检测，可缩短检测时间及成本，为氨基酸检测分析提供参考。

1材料与方法

1.1仪器及试剂

液相色谱仪：日本岛津公司LC20ADXR型（SIL-20ACXR自动进样器，SPD-M40二极管阵列检测器，RF-20A荧光检测器）；色谱柱：氨基酸分析柱150 mm×4.6 mm（内径），3.5μm；电子天平：ME204/02（梅特勒公司）；17种氨基酸混合标准溶液（购于岛津公司）；正缬氨酸和肌氨酸混合内标溶液（购于岛津公司）；OPA溶液、FMOC溶液和硼酸盐缓冲液（购于岛津公司）；甲醇、乙腈（色谱级）。

1.2实验方法

1.2.1流动相配制

流动相A：称取十二水合磷酸氢二钠4.50g，十水合四硼酸钠4.75g，加水1000mL，用36%盐酸（约1.5mL）调pH至8.2，用0.45μm滤膜过滤。流动相B：取甲醇450mL，乙腈450mL，水100mL。

1.2.2在线衍生程序

吸取5.0μL硼酸盐溶液，抽取样品2.0μL，吸吐空气液体混合，再洗针，吸OPA衍生试剂10μL，吸吐空气液体混合，一级氨基酸反应等待0.5min，洗针，吸FMOC衍生试剂1μL，吸吐空气液体混合，二级氨基酸反应等待0.5min，洗针，吸磷酸稀释液10μL，吸吐空气液体混合，进样。

1.2.3梯度洗脱

初始流速：1.0mL/min，具体步骤见表1。

1.2.4检测器波长

二极管检测器338nm（一级氨基酸），262nm（二级氨基酸）夹缝4nm；UV检测器：激发波长340nm，发射波长450nm（一级氨基酸），激发波长262nm，发射波长305nm（二级氨基酸）。

1.2.5样品前处理

准确称取试样1g左右，用0.05mol/L的盐酸定容制成氨基酸总浓度约为0.5～1mg/L的试样，再准确移取1.0mL试样，加入混合内标50μL，待测。

2 结果与讨论

2.1 结果 17种氨基酸的标准色谱图见图1～4

2.2 标准曲线

分别吸取5.0μL、10.0μL、20.0μL、50.0μL、100.0μL、150.0μL的氨基酸混合标准溶液，按1.2进行测定，结果经换算后，以氨基酸的质量浓度（xμg/mL）对峰面积（y）做线性回归曲线，17种氨基酸的线性回归方程及最低检出限（LOD）见表2。

2.3 葡萄酒与黄酒样品中游离的氨基酸

检测应用

任选某葡萄酒及黄酒进行游离的氨基酸检测，谱图见图5、图6，并对葡萄酒及黄酒中游离的氨基酸进行精密度研究及加标回收试验。

3 实验结果与分析

从标准色谱图及样品检测图中可知，采用此分析方法能够很好地将17种游离氨基酸分离，出峰时间稳定，也可看出二级氨基酸（脯氨酸）通过不同检测波长得到了很好分离；从标准曲线中可知，荧光检测器和二极管阵列检测器均有良好的线性，相关系数r在0.9995～0.9999之间；方法精密度测试葡萄酒RSD6在2.4%～6.7%，黄酒RSD6小于7.5%，表明方法精密度满足要求；当信噪比为3时，使用二极管阵列检测器检测限为0.28～0.85mg/L，使用荧光检测器检测限为0.083～0.64mg/L，满足检测标准要求；对两类酒进行加标回收试验，葡萄酒的回收率在85.4%～107.3%之间，黄酒回收率在80.6%～108.9%之间，效果理想。

4 结语

文中建立的氨基酸在线衍生反应，二极管阵列检测器串联荧光检测器，并同时采用混合内标法，多波长的检测方法，实现了17种氨基酸的分离及氨基酸的自动衍生，重复性好，灵敏度高，提高氨基酸的定性及定量准确，降低手工繁琐操作，可轻松应对酒类、药品、保健品等的氨基酸检测。

参考文献

[1]于世林.高效液相色谱方法及应用[M].化学工业出版社，2001：243-252.

[2]Angelika Gratafeld-Huegsge.Senstiti and rialible amino acid analysis protein hydrolysates using the Hp1100series HPLC[R]，1999：2-4.