环状RNA 在缺血性脑卒中领域的研究进展

唐 琛，兰 瑞，付雪琴，王玮玮，邹旭欢，王漫漫，李泓宇，刘 双

（1.河南中医药大学，郑州 450000；2.河南中医药大学第一附属医院，郑州 450000）

缺血性脑卒中是由于血栓阻塞大脑动脉而出现局部脑组织缺血缺氧的一种血管疾病，已经成为了全球致残和死亡的第二大原因［1］。 急性缺血性卒中会引起不可逆转的脑损伤，最终导致局灶性神经功能障碍［2］。 患者由于神经功能的损伤，失去了正常工作和学习的能力，给国家与人民带来了沉重的负担。 最近有证据表明，非编码RNA 参与了缺血性脑卒中的细胞和分子过程，触发了特定的生理病理反应，对卒中后的功能恢复造成了较大影响［3－4］。

近年来，随着检测技术的不断发展，越来越多非编码RNA 在不同生物学过程中被发现。 环状RNA 是一种非编码RNA，其经历了一个环化过程，没有典型末端结构，是一种共价闭合的连续环［5］。circRNA 能通过调节microRNAs 来调控基因表达，并作为潜在的生物标志物发挥作用。 其对RNA 外切酶具有抵抗力，能够被microRNA 转化为线形RNA，成为内源RNA 的竞争者。 circRNA 能在体内进行翻译，其异常的表达与人体多种疾病都具有联系［6］。

1 缺血性脑卒中的病理机制

缺血性脑卒中的基本病理因素是血管内的血栓形成，进而造成局灶性神经元缺失和脑组织的坏死。 50%的缺血性脑卒中是由动脉粥样硬化及其斑块破裂所引起，20%是心源性的脑卒中，25%是由小血管病变所致的腔隙性脑梗死，5%的缺血性卒中是由一些特殊原因，如颅外动脉夹层等因素导致［7］。卒中后，机体经历了小胶质细胞的激活，线粒体功能障碍，内质网应激等多个病理过程。 当卒中发生后，神经元细胞形态发生变化，程序性死亡通路被激活［8］；损伤的脑细胞释放出鞘氨醇－1－磷酸，趋化因子等多种物质，促使小胶质细胞迅速向病变部位迁移，并使其形态与功能产生巨大变化，对死亡细胞和细胞碎片进行吞噬［9］。 脑组织缺氧后，启动糖酵解进行能量代偿，代偿产生的乳酸使pH 下降，引发酸中毒和线粒体膜电位的降低。 同时能量代谢障碍使ATP 酶所依赖的离子泵失活，引起细胞内的钙离子超载，对线粒体造成损伤［10］。 在脑组织恢复血供后，“缺血－再灌注损伤”对内质网的稳态造成影响，使得将大量未折叠的错误蛋白在内质网中聚集，激活未折叠蛋白反应，进一步加重脑损伤，甚至引发细胞凋亡［11］。

2 circRNA 的生物学功能

1976 年，circRNA 首次被人类报道发现［12］。 由于数量较少，circRNA 最初被研究人员认为是一种“类病毒”，是选择性剪接错误产生的副产品，对某些高等植物具有致病性。 随着生物信息技术的不断发展，经过大量的转录分析后，越来越多的circRNA 出现在人类的视野中［13］。 Salzman 等［14］不仅在人类的细胞中检测出了多种circRNA，还证明了这是人类细胞基因表达程序的普遍特征。 研究发现，组织细胞中circRNA 的含量比长链信使RNA（linear mRNA）更为丰富，有些甚至能够达到linear mRNA 的10 倍以上［15－16］。 此外，circRNA 在人体组织中的分布也十分广泛，其存在于各种器官和组织，如大脑、肠道、心脏、肝、肺、皮肤、骨骼肌、脂肪、血管等［17］。 circRNA 可根据结构分为内含子环化、外显子环化以及内含子－外显子共同环化三种类型［18］；与linear mRNA 相比，其元典型的末端结构，circRNA 的3’和5’端连接在一起，形成了一个共价闭合 的 环 状 结 构， 因 此 其 更 加 稳 定［19］。 由 于circRNA 的独特结构，使它们能够在样品处理中选择性富集，更适合一些疾病的诊断，其在某些疾病当中的异常表达已得到证实，如神经元紊乱、动脉粥样硬化等［20］。 circRNA 有一定的特异性，在不同的时间、不同物种、不同疾病中的表达差异巨大；而且circRNA 还能模拟竞争性内源RNA 的角色，改变基因的表达方式［21］。 微小RNA（microRNAs）是一种小型非编码RNA，其参加了细胞增殖、迁移、分化和凋亡在内的多种细胞事件的转录后基因表达调控，在基因调控与生物的正常发育方面扮演着重要角色［22］。 研究表明，部分circRNA 可以通过调控microRNAs 的活性，从而在基因表达调控中发挥着关键作用，这一过程被称为microRNA 海绵［23］。 值得关注的是，尽管circRNA 在基因表达调控中的机制和其确切作用尚未被完全阐明，但学者普遍认为，circRNA 在未来具有很大潜力成为临床诊断标记物和疾病的新型治疗靶点。

3 circRNA 与缺血性脑卒中的相关性

由于只有一小部分基因能够合成circRNA，circRNA 的表达水平在所有组织中都较低。 然而，在大脑中circRNA 的含量远高于心脏、肝、肺等其他组织［24］。 在人脑中发现的circRNA 高达65 731种［25］，因此circRNA 很有可能参与了大脑的功能调节。 最近的研究结果显示，circRNA 及其调控网络与神经系统和血管系统关系密切，circRNA 可以抑制神经元凋亡和自噬，增强神经可塑性，促进微血管的生成，减少血脑屏障的损伤［26］。 脑卒中发病机制与神经炎症、能量衰竭、兴奋性毒性、细胞凋亡、氧化应激、铁死亡等相关［27－28］，上调卒中后miRNAs水平，如miR-9、miR-424、let-7c、miR-99a、miR-207、miR-29c、miR-122 和miR-210 等能够预防上述病理事件。 卒中后改变的circRNAs 被发现包含许多miRNAs 结合位点，表明它们可能调节miRNA 介导翻译过程，从而影响脑卒中的病理过程［29］。

4 缺血性脑卒中领域circRNA 的应用

4.1 circRNA 有望成为缺血性脑卒中的治疗靶点

随着高通量测序技术的不断发展，circRNA 在缺血性脑卒中领域的研究也不断深入。 大量的临床观察和实验研究证明，多数circRNA 能够通过海绵吸附microRNA 或作用于下游调节因子等方式参与缺血性脑卒中的调控。 虽然circRNA 的具体调控机制仍需要进一步的研究，但不少学者认为在缺血性脑卒中领域circRNA 具有非常良好的应用前景。circRNA 在临床诊疗上具有重大意义，其对缺血性脑卒中具有双重调节作用。 某些circRNA 能够减轻急性缺血性脑卒中（acute ischemic stroke，AIS）的炎症反应、保护星形胶质细胞、增强神经元的可塑性，促进患者卒中后的功能恢复。 而另一些circRNA 则发挥负面作用，如激活脑梗死周围皮质的星形胶质细胞；加剧脑水肿；加重缺血性卒中急性期的脑损伤等。 增加具有保护作用circRNA 的表达，可以促进患者的病情恢复；对负面效果的circRNA 进行沉默或者基因敲除，同样能够对脑卒中起到治疗作用（表1）。

表1 circRNA 在缺血性脑卒中领域的意义Table 1 Significance of circRNA in the field of ischaemic stroke

4.1.1 缺血性脑卒中后发挥保护作用的circRNA

circSCMH1：Yang 等［30］发现，与常人相比，急性缺血性卒中患者血浆中环状 RNA SCMH1（circSCMH1）的水平显著降低，在卒中小鼠的血浆和梗死灶周围皮质中circSCMH1 的水平也明显下降。 并且使用细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）技术，将circSCMH1 输入卒中患者脑内，显著促进了患者卒中后的功能恢复。 证明circSCMH1 的应用增强了神经元的可塑性，抑制了神经胶质细胞的反应和外周免疫细胞的渗透。

circRNA-0025984：Zhou 等［31］使用荧光素酶报告基因分析，证实了circRNA-0025984 和ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase 1（TET1）分别是miR-1433p 的海绵和靶标。 在模拟缺血条件下培养的星形胶质细胞中，circRNA-0025984 显著减少。 circRNA-0025984 过表达明显减少了星形胶质细胞的自噬和凋亡，这种神经保护作用与miR-143-3p 的直接海绵作用有关，miR-143-3p 进而直接靶向TET1。 TET1 通过使其启动子去甲基化而显著诱导ORP150 表达，从而增加GRP78 水平。 该研究表明circRNA-0025984 可 以 通 过 miR-143-3p／TET1／ORP150 通路减轻缺血性卒中损伤并保护星形胶质细胞。

circ-FoxO3：Yang 等［32］发现在小鼠大脑中动脉阻塞／再灌注模型中，circ-FoxO3 上调了脑微血管内皮细胞的自噬通量。 circ-FoxO3 通过与mammalian target of rapamycin（mTOR）和E2F1 相互作用激活自噬，从而触发细胞毒性聚集体的自噬降解。 自噬能够把受损的细胞器清除，并将它们转化为营养物质，从而确保细胞的病理状态下存活［33］。 circ-FoxO3 通过抑制mTORC1 来促进自噬，以减少缺血／再灌注时血脑屏障的损伤。

circ-DLGAP4：Zhu 等［34］采用定量聚合酶链式反应检测了170 名AIS 患者外周血单核细胞中circ-DLGAP4 和miR-143 的表达。 研究显示AIS 患者外周血单核细胞中circ-DLGAP4 的表达水平明显下调，且与miR-143 的表达水平呈负相关；而miR-143已经被证明是一个促炎基因［35－36］。 circ-DLGAP4 能通过海绵吸附促炎microRNA，如miR-143，来减轻AIS 的炎症反应，且其表达水平与AIS 病情严重程度呈负相关。

4.1.2 缺血性脑卒中后发挥损害作用的circRNA

circCDC14A：Zuo 等［37］发现在急性卒中后，患者血 浆 中 circCDC14A 表 达 明 显 升 高， 证 实circCDC14A 和卒中有关，并且可作为急性缺血性卒中诊断和预测预后生物标志物［38］。 进一步研究发现，通过慢病毒干扰卒中小鼠circCDC14A 表达，可显著减少再灌注72 h 的脑死塞体积和3 d、5 d、7 d梗死区皮质活化的星形胶质细胞密度。 表明下调circCDC14A 表达能减轻脑梗塞周围皮质星形胶质细胞的激活，从而减轻缺血性卒中急性期脑损伤。

circTTC3：Toll like receptor 4（TLR4）已被证实在卒中进展过程中参与神经干细胞的调控［39］。Yang 等［40］发现脑缺血再灌注损伤小鼠circTTC3的表达显著增加，circTTC3 的缺失可减轻脑梗塞、改善神经功能和降低脑含水量。 同时，circTTC3 的缺失下调了TLR4 的表达，miR-372-3p 抑制剂可以逆转这一作用。 研究证实，在脑梗死中，circTTC3 可通过miR-372-3p／TLR4 轴调控脑缺血再灌注损伤。

circCELF1：Li 等［41］通过RT-qPCR 法和Western blot 法分别检测了RNA 和蛋白质的表达水平，从而探究circCELF1 的表达对星形胶质细胞凋亡和自噬的影响。 RT-qPCR 的结果分析表明，在缺氧－葡萄糖剥夺／复氧（OGD／R）诱导的星形胶质细胞模型中，circCELF1 的表达显著增加，通过上调NFAT5 水平，诱导星形胶质细胞的凋亡和自噬。 在circCELF1的基因敲除后，星形胶质细胞的凋亡和自噬受到了抑制。 用短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAO）小鼠模型进行的体内研究也表明circCELF1 的基因敲除有助于减轻神经损伤。

circHIPK2：Wang 等［42］发现，在神经干细胞中过表达的circHIPK2 减少了神经元的分化；而circHIPK2 的沉默促进了神经元的分化。 沉默circHIPK2 后对神经元具有持续的保护作用。 除此之外，研究还发现精胺氧化酶（spermine oxidase，Smox）是circHIPK2 重要的下游调节因子，而Smox属于多胺氧化酶的一种，其已经被证明与缺血性脑损伤密切相关［43］。 沉默circHIPK2 可以有效促进卒中后的功能恢复，改善脑可塑性；circHIPK2 的沉默有望成为缺血性卒中治疗的有效手段。

4.2 circRNA 有望成为缺血性脑卒中的生物标记物并进行预后评价

生物标记物有助于进行疾病的早期诊断及后期监测，对了解疾病的病因和发病机制具有很好的辅助作用。 长链非编码RNA（lncRNA）已经被认为是卒中潜在的生物标记物［44］。 在缺血性脑卒中的发生发展中，circRNA 同样起到了重要作用，其成为缺血性脑卒中诊断方法和评估患者预后的可能性正在被众多学者关注。

Zu 等［45］对200 例72 h 内AIS 的患者进行了研究，发现大动脉粥样硬化性卒中、小动脉闭塞型卒中、心源性栓塞型卒中3 种circRNA 水平均显著升高；在起病24 h 内入院的患者中，早期神经功能恶化（early neurological deterioration， END） 患 者 的circFUNC1 水平显著高于无END 的患者。 发病24 h 内的circFUNDC1 的表达水平与患者的基线及第7天NIHSS 评分呈正相关。 研究表明，在卒中24 h 之内，检测外周血中circFUNC1 水平能够反映神经功能障碍的严重程度，对于急性卒中的转归和长期存活而言，circFUNC1 可能是一个潜在的预测指标。

Zheng 等［46］对急性缺血性卒中患者进行了一项病例对照研究，探究了患者NIHSS 评分、脑缺血时间与hsa＿circ＿0004099 表达水平的相关性，并构建了接收者操作特性分析（ROC）曲线。 结果表明，NIHSS 评分、脑缺血时间均与hsa＿circ＿0004099 表达水平呈负相关；hsa＿circ＿0004099 的表达水平在一定程度上反映了脑缺血的严重程度。 ROC 曲线分析显示，hsa＿circ＿0004099 的表达曲线下面积（AUC）是0.923，其对AIS 的发生有良好的预测价值。 因此hsa＿circ＿0004099 是一种能够诊断AIS 和判断患者预后的潜在工具，具有极大的临床价值。

Liu 等［47］从大脑中动脉闭塞小鼠的缺血半暗带中筛选circOGDH，并采用定量聚合酶链式反应检测AIS 患者血浆中的circOGDH 含量。 结果显示，大脑中动脉闭塞小鼠的缺血半暗带和AIS 患者血浆中的circOGDH 表达显著提升。 与无脑血管疾病的对照组相比，circOGDH 的表达增强了50 倍以上。 此外，在AIS 患者血浆中circOGDH 的表达水平与缺血半暗带的大小呈正相关。 这些结果表明circOGDH 可能是检测缺血半暗带的一种敏感的特异性标记物；在临床中，检测患者血浆中circOGDH 的含量将是一种方便、快速、经济的缺血半暗带预测方法。

5 总结和展望

缺血性脑卒中的早诊断，早治疗是影响患者预后转归的关键所在。 现今缺血性脑卒中的诊断主要依靠影像学检查，如CT、MRI 等方法，暂时缺乏能够广泛运用于临床和判断患者预后的生物标志物［48］。 目前的治疗方式以药物治疗、血管治疗以及静脉溶栓等方式为主；但静脉溶栓治疗存在治疗时间窗口窄、疗效差等缺点。 因此，寻找可靠的生物标记物和新型治疗方法对本病至关重要。 近年来，随着高通量测序技术的不断发展，人们对非编码RNA 的研究也逐渐增多。 研究发现，在神经血管单元中，circRNA 扮演了重要角色，参与了缺血性脑卒中如神经炎症、神经元死亡、血脑屏障损伤、动脉粥样硬化等多个环节，其可能是缺血性脑卒中诊疗的理想靶点［49］。 尽管circRNA 与缺血性脑卒中之间的关系研究还处在初级阶段，但随着众多学者的密切关注， circRNA 已经成为了新的研究热点，circRNA 有望在未来几年内应用于缺血性脑卒中的诊断和治疗。

缺血性脑卒中后，circRNA 出现显著的差异性表达，大多circRNA 可通过海绵吸附microRNA，引起microRNA 下游脑卒中相关靶基因的释放，通过作用于星形胶质细胞、激活细胞自噬、减少炎症反应等过程对缺血性卒中进行调控。 动物实验和临床研究结果显示，沉默或过表达某些circRNA 能够对缺血性脑卒中起到显著治疗作用；circRNA 的研究成果为缺血性脑卒中的诊疗提供了新的可能。但由于目前对circRNA 的机制研究仍较缺乏，circRNA 的应用仍面临许多挑战，希望在未来能够对circRNA 的作用进行深入研究，并将其应用于临床，成为缺血性脑卒中的新疗法。