气虚湿瘀型肾纤维化动物模型的研究进展

高冉冉申 振连梦慧韩 聪李 伟

（1.山东中医药大学中医学院，济南 250014；2.山东中医药大学第一临床医学院，济南 250014；3.山东中医药大学，济南 250014；4.山东中医药大学附属医院，济南 250014）

动物模型最早可追溯到公元前6 世纪，人类疾病发生发展复杂，借助动物模型间接研究可调控变量，有助于方便、有效地认识人类疾病的发生发展规律，促进医学发展与进步［1］。 传统医学因其独特性及病证复杂性，单纯西医病理模型不能充分反映其病因及临床实际，在现代实验研究中病证结合动物模型发挥着重要作用。 近年来有关中医动物模型的研究不断发展，逐渐由单纯病理模型到病因模型再到病证结合模型，使动物模型同时具备疾病与证候的特征，更加贴近于中医理论特色。 但是目前病证结合动物模型仍缺乏规范化的评价体系及可重复性，建立规范且具有复刻性的病证结合动物模型成为近年来研究的热点。

气虚湿瘀是慢性肾病（chronic kidney disease，CKD）的常见证候，肾纤维化是CKD 的主要病理特征，胡洪贞等［2］提出CKD 以气虚为本，血瘀、湿浊为标，主要由劳倦、内外湿邪及外邪侵袭等所致。 气虚湿瘀型肾纤维化动物模型的建立有助于把握该证候疾病的本质及病理生理变化特点，利于CKD 的研究及更好地指导临床用药诊疗。 目前并无气虚湿瘀型肾纤维化动物模型造模的先例，本文从病理造模、病因造模及病证结合造模、模型评价角度出发，综述并探讨气虚湿瘀型肾纤维化动物模型的造模方法及模型评价，以期为气虚湿瘀型肾纤维化动物模型的构建及复制提供参考。

1 气虚湿瘀

1.1 气虚血瘀

中医认为气为血之帅，气行则血行、气止则血止，气虚无力推动血液运行，血行不畅而致瘀；血为气之母，血瘀致脏腑失养，生化乏源，进一步导致气虚，气虚与血瘀二者互为因果，相互关联，临床多气虚血瘀并见。 该证候动物模型的构建可从其病理及病因角度出发，单因素与多因素相结合。

1.1.1 病理造模

气虚血瘀多表现为免疫学、血液流变学及行为学上的改变如免疫功能下降、能量代谢紊乱、神疲乏力、血液高凝状态、黏度增高、纤维蛋白原含量增高等。 病理造模根据气虚血瘀特定的病理表现，运用相关实验技术对动物进行造模，使动物表现出该特定的病理改变。

林家茂等［3］通过阿霉素腹腔注射联合丙基硫氧嘧啶混悬液灌胃，从血流动力学方面降低心肌收缩力，减少心排量制备心气虚兼血瘀证心衰模型，造模6 周后，造模组出现饮食量减少、生长缓慢、精神萎靡、活动力下降、甲状腺激素T3、T4 降低等气虚表现以及毛色枯槁、爪甲紫绀、左室射血分数下降、心排量减少等血瘀表现，提示心气虚兼血瘀证的SD 大鼠模型造模成功。 罗泽飞等［4］以环磷酰胺腹腔注射使血液呈高凝状态制备气虚血瘀大鼠模型，模型组大鼠全血黏度、血沉、血浆黏度、红细胞压积和内皮缩血管肽（endothelin，ET）-1 均明显高于空白组，NO 含量低于空白组，提示造模成功。 张玉昆等［5］通过注射博来霉素生理盐水溶液（5 mg／kg）法过表达TGF-β1，制备气虚血瘀动物模型，造模结束后大鼠的中、低、高切变率的全血黏度、血小板聚积性相关指标cGMP、血小板纤溶相关指标PAI-1以及血小板释放相关指标如β-TG 和PF4 水平均升高，cAMP、TT 缩短，并以方测证，运用行气活血方丹参饮后，大鼠气虚血瘀状态得到改善。 此外，还有研究采用利血平肌肉注射，消耗小鼠体内儿茶酚胺导致脾虚，模型小鼠出现耳缘、脚趾等局部微循环血流量的降低，表现出气虚血瘀的临床及病理改变［6－7］。

1.1.2 病因造模

病因造模指基于中医病因学说和发病理论将符合单一或多种病因理论的致病因素作用于实验动物［8］，符合“因－证理论”，符合中医机理，具有逻辑性。 气虚血瘀依据中医“劳则气耗、饥则气损”的病因，多采用力竭游泳、疲劳跑步、睡眠剥夺法进行“气虚血瘀”模型构建。 扈新刚等［9］以大鼠沉入水中10 s 不能自行浮出水面为力竭标准，制备大鼠气虚血瘀模型，对大鼠表征进行动态观察并检测相关血液流变学指标，发现经过长期的力竭游泳后均表现出气虚相关表征，血液流变学指标符合气虚血瘀表现。 郝婷婷等［10］通过对大鼠每天睡眠剥夺16 h造成中枢性神经疲劳并联合长时间站立所致形体疲劳制备气虚血瘀型大鼠，大鼠出现舌象、足底图像R、G、B 下降，足底变紫暗、舌呈淡紫，耳廓、足底体表激光多普勒血流灌注量降低等气虚血瘀表现。后陈进成等［11］采用睡眠剥夺法成功复制气虚血瘀动物模型。 甘加宽等［12］曾用睡眠剥夺、力竭游泳、睡眠剥夺结合力竭游泳3 种方法进行小鼠造模，对小鼠体重、抓力、舌象、脉搏、脾指数与胸腺指数、脾淋巴细胞亚群进行比较，结果显示三种造模方式均能引起小鼠乏力，睡眠剥夺与力竭游泳均能引起小鼠脉象变细，并最终得出睡眠剥夺组为三者间更优造模方法。 李雅君等［13］通过饥饿和力竭游泳的方法成功复制大鼠气虚血瘀模型，与王晚霞等［14］的实验结果基本一致，表现为血液黏度低、纤维蛋白原等凝血因子显著不足的低流变性型血瘀证。 彭桂原等［15］采用小承气汤耗气破气加饥饱失常（足量给食－限量给食循环）进行气虚造模后，再用光化学反应法制备气虚血瘀证耳蜗Corti 器毛细胞损伤的豚鼠动物模型，造模后豚鼠均出现不同程度的中医气虚证的典型症状表现，耳蜗病理切片提示耳蜗血管纹、Corti 器等结构出现不同程度的缺血性病变，体现血瘀表现，提示造模成功。

1.1.3 病证结合造模

病证结合造模即在充分考虑气虚血瘀证类疾病病因的前提下，人为地制造病理产物，使之既符合西医病理特点又符合中医证候特点，同时使用一些动物体表特征来模拟人类证候特征的生物表征，可更好地体现中医理论和评价中药疗效［16］。

杨霓芝等［17］在Thy-1 抗体制备慢性肾炎模型的基础上采用游泳疲劳实验制备气虚血瘀病证结合模型，模型组大鼠出现气虚血瘀表征，机体细胞免疫功能紊乱，血液流变学异常。 任建勋等［18］依据“劳则气耗”理论，采用睡眠剥夺复合冠状动脉左前降支结扎的方法建立心力衰竭气虚血瘀病证结合大鼠模型，模型组体重、抓力、脉搏幅度及自主活动总路程和平均速度较空白对照组均明显下降，主动脉血流速度下降，在多因素复合干预下气虚血瘀病证结合更为明显。 王瑾茜等［19］通过控食复合力竭游泳联合结扎左冠状动脉前降支造模，造模结束后分析大鼠舌面RGB 值属“紫舌”，舌面微血管数量增加，符合冠心病气虚血瘀病证结合模型特点。 戴姣等［20］依据“生物表征”及“因、脉、证、治”理论通过声、光、电、夹尾、冰水浴、束缚等消耗正气，“元气既虚，必不能达于血管；血管无气，必停留而瘀”，从而构建气虚血瘀大鼠模型，通过注射野百合碱诱导肺动脉高压，大鼠注射部分出现不同程度的紫肿、出血等血液循环瘀滞表现，同时血流动力学指标体现血瘀。

综上，气虚血瘀模型多表现为血流动力学及肢体行为学上的改变，可采用化学法如阿霉素、环磷酰胺、博来霉素等靶向病理造模，同时采用劳倦过度、饮食失节的方法进行病因造模，病证结合。

1.2 气虚湿盛

气主推动，气行津行，气虚气化无力、气机阻滞可致运化失司，水湿停聚。 《景岳全书》云“盖水为至阴，故其本在肾；水化于气，故其标在肺；水唯畏土，故其制在脾”。 肾者水脏，主津液。 肾气虚，气化不利，水液输布失常，则湿浊内生。 肾气虚，邪能客之，外湿客表，久则深入血络，导致气滞湿阻，气化失司，加重湿浊。 湿浊内停化热，可见湿热，而浊毒日久损及肾阳，失于温煦，可致寒湿。 故从湿热与寒湿两方面论述。

1.2.1 湿热证

肾者，胃之关也，关门不利，故聚水而从其类也。 肾气亏虚，失于气化蒸腾，可见水湿停聚。 徐灵胎云：“有湿则有热，虽未必尽然，但湿邪每易化热。”肾气亏虚，津液输布排泄障碍，水湿停聚，郁久化热。 肾与脾先后天相互滋生、相互影响，薛生白云“太阴内伤，湿饮停聚，客邪再至，内外相引，故病湿热”。 嗜食肥甘厚味、饮酒无度、年老久病或房劳过度损伤脾肾、聚湿生热，加之外界环境湿热氤氲，同气感召，另受客邪引动致湿热，故湿热模型构建可从“内湿＋外湿＋客邪＋脾肾亏虚”角度出发，内外因结合。

（1） 病理造模

湿热证病理多表现为舌苔黄腻、小便黄赤、大便黏滞或溏泄、炎症因子升高等，杜恒［21］通过在口服并定时尾静脉注射牛血清白蛋白（BSA）的基础上注射葡萄球菌肠毒素B 制备大鼠肾炎湿热证模型，大鼠出现大便溏泄等湿热证表征同时伴有IL-6 等炎症因子升高。 齐文杰等［22］、Cao 等［23］通过用胆胰管推注5%牛磺胆酸钠、异硫氰酸α－萘酯和四氯化碳进行病理造模，呈现湿热证候。 此外，多研究发现在肥甘饮食＋恒温恒湿的基础上加用水杨酸、大肠杆菌、克林霉素磷酸酯、鼠伤寒沙门氏菌灌胃等生物、化学因子均可制备湿热模型［24－27］。

（2） 病因造模

基于饮食不节、外感湿邪及脾胃不和酿湿生热病因，季旭明等［28］通过高脂饮食＋游泳内外相引制备湿热证小鼠模型，模型小鼠出现脂质代谢紊乱。王婷等［29］通过高蛋白饲料＋糖水＋酒营造内湿，恒温恒湿气候箱制备外湿，分别用花生油脂模拟肥甘厚腻致脾气虚、番泻叶寒凉致脾阳虚，两种湿热模型均出现喜聚堆蜷卧、喜闭眼、嗜睡懒动、被毛无光泽、尾部肛周、腹部毛色黯黄、饮水减少、大便溏泄等湿热证的临床表现和体征，以及干扰素γ（INFγ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）等炎症因子的改变和肠道菌群结构的失调。 周祎青等［30］通过高蛋白饮食＋人工气候箱＋隔日灌服白酒＋跑步制造“外湿＋内湿＋脾虚”的复合因素造模，模型组小鼠出现湿热证症状，机体发生炎性改变以及小肠组织黏膜层上皮细胞破坏，舌组织黏膜层角化增加、舌乳头排列不均匀等湿热证的病理表现。

（3） 病证结合造模

病证结合模型可反映疾病病理与湿热证候特征，熊宁宁等［31］早在1991 年就报道了采用给家兔注射血清白蛋白并加用大肠杆菌内毒素感染造成免疫复合物沉积模仿人类反复感染后导致的湿热型进行性肾炎，制备肾炎湿热病证结合模型。 刘晓鹰等［32］复刻肾炎湿热动物模型，通过在对Wistar 大鼠口服并定时尾静脉注射牛血清白蛋白的基础上，分别施以葡萄菌肠毒素B 或高糖高脂饮食联合恒温恒湿外环境影响构建湿热模型动物，造模中晚期动物出现血尿、蛋白尿、血清胆固醇、三酰甘油、血肌酐、尿素氮等升高，弥漫性肾小球系膜区增宽、系膜细胞、系膜基质增生、肾小管间质炎细胞浸润等类似于肾炎湿热证的生化及病理改变。

1.2.2 寒湿证

疾病日久，损及肾阳，肾阳不足，命门火衰，火不暖土，寒湿内生，另加之外受寒邪影响，内外寒湿互病。 劳则耗气、饮食失节、苦寒药物、年老久病等损伤脾肾、寒湿内生，外界寒湿环境、寒湿邪气乘虚而入，内外因相互影响导致寒湿证候。 故寒湿模型构建可基于“内伤＋外感”，病因病理相结合。

寒湿证病理多表现为畏寒肢冷、肤色青暗、大便稀溏、体重下降、炎症因子升高、血清皮质醇下降等，病因多与饮食不节、苦寒泻下、年老久病气耗阳损、外感寒湿侵袭等有关。 戴冰等［33］基于抑制下丘脑－垂体－肾上腺轴原理通过给予25 mg／kg 氢化可的松灌胃10 d 后小鼠出现肢尾冷、体重下降、大便稀溏等寒湿表征。 刘同林［34］、吴君等［35］选取老年大鼠与青年大鼠比较，发现老年大鼠具有体温下降、尿量增多、血清皮质醇下降等阳虚寒湿表现。靳荃等［36］以冷水游泳力竭联合人工气候箱模拟外界寒湿环境制备小鼠寒湿证疼痛模型，造模后小鼠出现尾巴皮肤青暗、体重增长变慢等寒湿证病理特征。 雷鸣等［37］基于外湿病因以温度4℃，湿度60%构建外湿环境进行寒湿痹阻模型造模，大鼠皮下胶原及肌组织出现肌纤维变性、坏死，纤维化伴淋巴细胞浸润提示造模成功。 王常松等［38］通过采取寒湿环境＋寒凉饮食＋高脂饲料的多因素造模，在外在表现及尿D－木糖排泄率、血浆胃动素等微观指标上均符合寒湿证模型特征。

综上，气虚湿盛证候模型分为湿热与寒湿两个方面。 湿热证主要根据中医“肥甘厚腻，酿湿生热”“湿热胶着，内外相引”理论再加以生活因素、生物化学因素等影响而建立，大致可概括为“内外湿热＋脾肾亏虚＋致病因子”的多因素病证结合造模。 气虚阳损可见寒湿，寒湿证动物模型可通过糖皮质激素等抑制下丘脑－垂体－肾上腺轴靶向病理联合中医寒湿“内生＋外感”病因建立。

2 肾纤维化病理模型

肾纤维化发生发展机制复杂，涉及多细胞及多条细胞信号通路，其动物模型的制备方式多样。 胡安康等［39］通过大鼠肾大部分切除（Platt 法）和腺嘌呤（Yokozawa 法）灌胃法制备肾衰竭模型，两组大鼠肾均见局灶性间质纤维化，伴大量淋巴和单核细胞的浸润。 麻志恒等［40］成功复刻5／6 肾切除慢性肾纤维化小鼠模型，可见肾小球明显肿大、增生，系膜细胞增殖变大变厚，局部粘连和硬化，基底膜增宽明显，肾小管管腔不完整，有蛋白管型，胶原纤维增生。 李艺文等［41］单侧输尿管结扎大鼠后，大鼠肾盂扩张、皮质变薄，上皮标志物E-cadherin 表达下降，肌成纤维细胞标志α-SMA 表达增加，EMT 形成，提示肾纤维化模型成功。 Han 等［42］用环孢素（30 mg／kg）灌胃配合低盐饮食建立环孢素肾毒性小鼠模型，造模后小鼠体质量减轻，肾功能下降，肾小球基底膜增厚、肾小管扩张，空泡化或萎缩。 高健［43］通过单侧肾切除加阿霉素尾静脉注射制作大鼠肾小球硬化模型，模型组可见肾小球局灶节段性肾小球硬化，肾小球毛细血管内皮细胞和足细胞肿胀、足突融合消失，加重病理进展，最终致肾纤维化。 多项实验研究采用链脲佐菌素均成功制备糖尿病肾病肾纤维化模型，方便稳定且对组织器官的毒性小，相对安全，实验动物的死亡率小［44－47］。

综上，肾纤维化造模方式多样，主要基于其病理变化可通过肾大部分切除、单侧输尿管结扎等外科手术方法及腺嘌呤、环孢素A 灌胃，阿霉素尾静脉注射、链脲佐菌素腹腔注射等化学方法造成肾功能和结构的损害，最终导致肾纤维化。

3 “气虚湿瘀”肾纤维化模型造模方法

气虚无力推动运化水湿，水液输布代谢障碍可致水湿停滞，湿饮停聚，客邪再至内外相引，故病湿浊。 湿浊阻滞气机加之热伤阴损络、寒凝络阻，使血瘀加重，湿瘀又可耗伤人体正气，故气虚湿瘀相互影响，互为因果。

目前并无气虚湿瘀型肾纤维化造模先例，基于以上气虚血瘀、湿热、寒湿证及肾纤维化造模方法，总结气虚湿瘀型肾纤维化模型可通过劳则气耗或饥则气损联合内外湿邪及多因素破坏肾结构及功能的原理制备，具体造模方法见表1。

表1 气虚湿瘀型肾纤维化模型构建方法Table 1 Method for constructing kidney fibrosis model of qi deficiency and dampness stasis type

4 “气虚湿瘀”肾纤维化模型评价

4.1 宏观表征

动物模型所指宏观表征常涵盖习性、一般生活状态、生命体征、外观形态及舌象等多个方面［48］。气虚运化失常可见饮食减少、体重下降以及消瘦等症状。 气为“神之母”，气充则神明，气虚则神衰，故气虚可见精神倦怠、眼光无神、活动性差。 脾气亏虚，脾失健运，肌肉毛发失于濡养可见皮毛色暗、无光；脾气亏虚转运不利、清浊不分可见大便稀溏。气虚无力推动血行，血液瘀滞，气虚血瘀常并见，血瘀多见舌质紫暗，舌面瘀斑瘀点，实验小鼠尾部可出现不同程度的瘀紫或青斑［49］。 湿热内蕴舌苔多黄腻，熏蒸水液常见小便黄赤，湿热壅阻大肠，大肠传导失常可见大便溏泄。 湿热下注而为蛋白尿，久则耗血伤阴，终致肾气匮乏，肾阳耗损，肾虚无力主水、司开合，而见尿少等症。 肾阳虚衰、失于温煦见畏寒肢冷、肤色青暗、大便稀溏、体重下降等症。 同时根据《中医临床诊疗术语证候部分（修订版）》、《中药新药临床研究指导原则》概括动物模型宏观表征主要为：（1）气虚：倦怠嗜睡，精神萎靡，四肢蜷缩，活动性差，对外界刺激反应迟钝；进食量逐渐减少，消瘦，大便稀薄；皮毛色暗、蓬松无光；（2）血瘀：舌面瘀点，舌质淡紫；尾部出现不同程度瘀紫或青斑。 （关于舌象分析多采用Adobe Photoshop CS5 软件进行，选取舌面3 点，读取像素区域R（红色）、G（绿色）及B（蓝色）分量值进行比较）；（3）湿热：小便黄赤、量少、泡沫尿；大便溏泄或黏滞；体温不变或升高；舌苔黄厚；（4）寒湿：畏寒肢冷、倦怠乏力、食少纳呆、小便清长，肢体水肿，大便溏泄，舌苔白腻。

4.2 实验室指标

所谓“正气存内，邪不可干”，有研究表明气虚证与机体免疫能力紊乱有关，临床上气虚患者多伴有免疫功能低下，CD4＋、CD19＋等免疫指标及血浆免疫球蛋白IgG、IgA 下降［50－52］。 2021 年国际血瘀证诊断指南［53］将血流动力学、血液流变学、血小板功能、凝血功能、纤溶功能列为血瘀证的主要诊断标准。 血瘀证血液流变学特征主要包括浓、黏、凝、聚四个方面，体现在血液黏度增高、血小板黏附率增高、凝血时间缩短、纤维蛋白原含量增高等。 Ran 等［54］采用血液流变学指标评价血瘀证大鼠模型，血瘀证大鼠的全血黏度和血浆黏度较正常大鼠显著增加。

钟云良等［55］综述见肾系疾病湿热证与感染之间存在一定的相关性，湿热证C－反应蛋白（CRP）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素－2（IL-2）、白细胞介素－6（IL-6）水平明显高。 此外，慢性肾病湿热病理可表现蛋白尿、血尿、胆固醇血症、氮质潴留、血流变异常等［56］。 李威莹等［57］得出脾胃湿热证模型评价多涉及血糖血脂、氧化应激、炎症细胞、水通道蛋白等指标。 陈佳美等［58］制定了湿热证动物的模型评价指征，通过评估氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）等氧化指标，IgM、IgG、CD4＋T、CD8＋T等免疫指标，CRP、TGF-α、IFN-γ、IL-6 等炎症指标，水通道蛋白（AQP2、AQP3、AQP4）等水液代谢相关指标进行评价。 糖尿病肾病寒湿证可见血清MCP-1、IL-6 等炎症因子升高［59］，在肾阳气虚寒湿证中血清皮质醇及三碘甲状腺原氨酸（T3）、甲状腺素（T4）下降［34］。 此外，血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、尿NAG 酶（NAG）、尿蛋白／肌酐比值升高，eGFR 下降是CKD 的主要表现。

4.3 病理表现

肾固有细胞凋亡，炎细胞浸润，肌成纤维细胞异常增殖，ECM 过度沉积最终形成肾纤维化，主要病理表现是肾小球的硬化、肾小管间质的纤维化以及肾内血管的硬化或堵塞等。 李春庆等［56］综述各医家研究，认为系膜细胞增生和基质增多、纤维素样坏死及炎细胞浸润是肾小球疾病湿热证的特异性表现。 寒湿证可表现为系膜细胞增生，小管上皮空泡样变，肾间质炎细胞浸润［60］。 局灶增生硬化、肾小球肥大在慢性原发性肾小球疾病气虚证中多见［61］。 血瘀证主要表现为胶原纤维增生、毛细血管襻内微血栓形成［62］。

综上，气虚湿瘀肾纤维化的模型评价标准主要涉及宏观表征、实验室指标以及病理改变3 个方面，宏观表征主要表现为气虚、血瘀与湿热、寒湿证的症状与体征；化学指标与病理改变通过现代分析检测技术，明确疾病引起的微观改变，将评价指标量化，具体评价标准见表2。

表2 气虚湿瘀型肾纤维化模型评价标准Table 2 Evaluation criteria of kidney fibrosis model of qi deficiency and dampness stasis syndrome

5 总结与展望

“病证结合”动物模型以中医理论为基础，要求不仅符合西医各种疾病的病理特征，具备与临床疾病相似的演变和发展过程，而且要与中医临床病证特点相结合，是中医药基础研究的重要手段。

气虚湿瘀型病证结合肾纤维化的造模方法基于中医病因并结合西医病理制备，可通过肾大部分切除、单侧输尿管结扎等外科手术方法或腺嘌呤、环孢素A 灌胃，阿霉素尾静脉注射、链脲佐菌素腹腔注射等化学方法建立西医肾纤维化模型，结合饥饿、力竭游泳、疲劳跑步、睡眠剥夺、高糖高脂饮食、外湿环境、灌服白酒、注射药物、选择年老体虚动物等单一或者复合手段建立气虚湿瘀模型，此模型同时满足病证特征，符合中医与现代医学理论，具有可行性。 此外，模型评价从疾病与证候分而论之，将中医临床表现与西医微观指标结合，多维度、标准化、具体化。 但是本证候模型无先例，造模中考虑条件众多，需下一步实验验证。 制备稳定有效，成本低，操作简便的气虚湿瘀型肾纤维化模型，可为气虚湿瘀型肾纤维化的研究提供有效的模型支持，并进一步促进其基础及临床研究，更有效地发挥中医药在肾纤维化中的治疗作用。