基于游离氨基酸的烤烟配打模块香型判别方法研究

陈红丽 周航 杨永锋 胡静宜 刘茂林 刘向真 贾涛

摘 要：为明确不同香型烤烟配打模块游离氨基酸组分差异，并实现对清香型、中间香型及浓香型烤烟复烤模块的准确分类，选取7个清香型、7个中间香型和8个浓香型烤烟配打模块为研究对象，对其游离氨基酸含量进行OPLS-DA分析，结合SVM模型进行香型判别。结果表明：不同香型烤烟模块游离氨基酸总量范围为13 141.72～27 695.47 μg/g，其中脯氨酸和天冬酰胺含量在各香型中占比最高，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、4-氨基丁酸、赖氨酸、组氨酸、色氨酸、精氨酸和游离氨基酸总量在不同香型间存在显著性差异。丙氨酸和天冬氨酸在OPLS-DA分析中VIP值大于1且在不同香型间差异显著（<0.05），可筛选为香型判定指标。基于21種游离氨基酸的前两种主成分构建的SVM模型对模块香型的判别率准确率为86.36%；基于筛选出的2个游离氨基酸特征指标构建的SVM模型判别准确率为90.91%。基于丙氨酸和天冬氨酸的SVM模型判别率和可信度都在较高水平，可应用于烤烟配打模块的香型判别。

关键词：配打模块；游离氨基酸；差异分析；正交偏最小二乘判别分析法；支持向量机

中图分类号：TS411                       文献标识码：A                      文章编号：1007-5119（2023）05-0079-07

Identification Methods for Flue-cured Tobacco Flavor in Blending and Threshing Module Based on Free Amino Acids

CHEN Hongli， ZHOU Hang， YANG Yongfeng HU Jingyi， LIU Maolin， LIU Xiangzhen， JIA Tao

College of Tobacco Science， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China; 2. Technology Center， China Tobacco Henan Industrial Co.， Ltd.， Zhengzhou 450000， China; 3. Baofeng Tobacco Redrying Factory， Tianchang International Co. Ltd.， Baofeng， Henan 467400， China）

 Aiming to clarify the differences of free amino acid components in different flavor types of flue-cured tobacco blending and threshing modules， and classify redrying modules of fresh flavor， neutral flavor and robust flavor types， the blending modules of 7 fresh， 7 neutral and 8 robust flavor types were selected， and their free amino acid contents were determined by OPLS-DA analysis， flavor types were identified by SVM model. Results showed that total free amino acids in different flavor types of flue-cured tobacco ranged from 13 141.72 to 27 695.47 μg/g， and the contents of proline and asparagine exhibited the highest among all flavor types. Significant differences among different flavor types occurred in the total amount of aspartate， glutamic acid， glycine， alanine， cystine， leucine， tyrosine， phenylalanine， 4-aminobutyric acid， lysine， histidine， tryptophan， arginine and free amino acid. In OPLS-DA analysis the VIP values of alanine and aspartic acid were above 1 and significantly different among various flavor types （p<0.05）， hence could be selected as evaluation indexes. The SVM model based on the first two principal components of 21 free amino acids exhibited an accuracy of 86.36%. The discriminant accuracy of SVM model based on two free amino acid characteristic indexes reached 90.91%. The SVM model based on alanine and aspartic acid exhibited high discrimination rate and reliability， and can be applied in the flavor discrimination of flue-cured tobacco blending modules.

 blending and threshing module; free amino acid; difference analysis; orthogonal partial least squares regression discriminant analysis; support vector machine

基金项目：河南中烟工业有限责任公司资助项目（ZW2014003）

作者简介：陈红丽（1979-），女，副教授，博士，主要从事烟草质量评价研究。E-mail：chenhonglili06@163.com

收稿日期：2023-05-18              修回日期：2023-10-16

烤煙香型长期以来一直是区别烤烟风格特征的重要指标，同时也是卷烟企业确定其产品配方的重要依据。目前，大多数对烟草香型的判定一直建立在评吸人员感官质量评价得分上。关于烤烟香型的机器判别也有部分研究，如郭东锋等将随机森林法引入烤烟香型分类研究中；邱昌桂等提出了基于致香成分结合GA-SVM算法的识别方法；李超等利用不同香型烤烟中114种化学指标建立Bayes定量判别模型，筛选出不饱和醛酮、氨基酸、碱、细胞壁物质等的含量，对烟叶香型判别具有良好的预测能力。但目前对于香型判别仍缺少高效识别模型，且未验证模型的适用性。

游离氨基酸是烟草中重要的含氮化合物之一，对烟草味道和烟气的丰满度有较大影响^[5-6]。在调制和醇化过程中，烟叶中的氨基酸会与还原糖发生美拉德反应，生成一系列醛类、醇类、杂环类等对烟草香味有重要影响的化合物。一般认为，游离氨基酸含量过高，抽吸时刺激性强烈；含量过低，则烟气劲头不足，丰满度差。过伟民等研究了烘烤过程中游离氨基酸含量组分的变化，游离氨基酸总体与烟叶质量呈负相关，其中苯丙氨酸、色氨酸、丙氨酸、脯氨酸和天冬酰胺四种组分在烘烤过程中变化最大，与烟叶品质相关性最高；孙晓伟等分析了不同海拔对烤烟中游离氨基酸的影响，游离氨基酸含量均以脯氨酸含量最高，谷氨酸和天冬氨酸含量次之，且变异系数较大，对烤烟质量影响较高；彭振兴等研究表明不同种植区域烤烟游离氨基酸存在显著差异，脯氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、组氨酸和色氨酸六种氨基酸组分在区域间存在显著差异，且清香型产区游离氨基酸含量低于浓香型产区。可见，不同香型烟叶氨基酸含量具有较大差异，有可能成为区分烟叶香型的特征指标。因此，本研究以7个清香型烤烟配打模块、7个中间香型烤烟配打模块和8个浓香型烤烟配打模块为研究对象，采用正交偏最小二乘判别法（OPLS-DA分析）和支持向量机（Support Vector Machine， SVM）分类判别模型，探索不同香型配打模块游离氨基酸含量的差异性及变化趋势，以期筛选出判别香型的游离氨基酸指标，为工业企业原料采购和配方调整提供理论依据，保障卷烟质量稳定。

1  材料与方法

1.1  试验材料

选取河南中烟工业有限责任公司2018年具有代表性的7个清香型烤烟配打模块，烟叶分别产自四川、福建、云南地区；7个中间香型烤烟配打模块，烟叶分别产自贵州、黑龙江、重庆地区；8个浓香型烤烟配打模块，烟叶来自河南产区。每种原料各10 kg，所有样品均为多等级混合打叶后的片烟，经各中烟工业有限责任公司技术中心收集，统

一复烤后制成。

1.2  试验方法

参考YC/T 282—2009和文献[13]的方法测定游离氨基酸含量。

1.3  数据处理

数据统计分析使用SPSS 27.0；利用SIMCA14.1进行正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），根据变量重要性投影（VIP）挑选差异物质；采用R语言软件“ggplot2”包进行主成分分析（PCA）结果提取和可视化作图，结合支持向量机（SVM）建立判别模型并对所选特征指标进行验证。

2  结  果

2.1  不同香型烤烟模块游离氨基酸含量分析

对3种香型烤烟模块的21种游离氨基酸进行差异显著性分析，结果见表1。清香型烤烟模块各游离氨基酸含量范围为2.94～7 679.44 μg/g，中间香型烤烟模块为3.96～8 465.70 μg/g，浓香型烤烟模块为6.30～12 093.79 μg/g，3种香型中脯氨酸（Pro）含量最高，其次为天冬酰胺（Asn），蛋氨酸（Met）含量最低。3种不同香型烤烟模块在天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、胱氨酸（Cys）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、赖氨酸（Lys）、4-氨基丁酸（4-Gaba）、苯丙氨酸（Phe）、组氨酸（His）、色氨酸（Trp）、精氨酸（Arg）及游离氨基酸总量上存在显著性差异（＜0.05），且浓香型烤烟模块＞中间香型烤烟模块＞清香型烤烟模块含量；苏氨酸（Thr）、天冬酰胺（Asn）、谷酰胺（Gln）、蛋氨酸（Met）、异亮氨酸（Ile）和脯氨酸（Pro）含量在不同香型模块中存在极显著性差异（＜0.01），浓香型模块含量极显著高于清香型和中间香型烤烟模块，但清香型和中间香型之间差异不显著。由图1可知，3种香型烤烟模块游离氨基酸总量基本呈正态分布，从主峰态势来看，浓香型烤烟模块游离氨基酸含量和其余两模块间存在显著性差异，清香型烤烟模块和中间香型烤烟模块间游离氨基酸含量存在差异，但不显著。

2.2  不同香型模块游离氨基酸成分OPLS-DA分析

2.2.1  不同香型模块游离氨基酸OPLS-DA得分图  不同香型烤烟模块特征图谱OPLS-DA得分（图2和图3）显示，从各模块样品点对点的表征上可以看出，不同香型烤烟模块间氨基酸含量有显著差异，22个烤烟模块被明显分为3类。本次OPLS-DA模型分析中的自变量拟合指数（）为0.991，表明主成分对矩阵信息的解释能力为99.1%；因变量拟合指数（）为0.867，表明预测主成分对矩阵信息的解释能力为86.7%，模型预测能力为0.663，和超过0.5表示模型具有良好的解释程度和预测能力（和数值越接近1说明模型越准确越可靠）。为了检验OPLS-DA模型有无过拟合，进行随机分组200次的置换检验对模型的可靠性进行验证，结果见图4。通过验证图（图4）可以看出，模型结果参数的回归线与纵轴的相交点为−0.916，小于0，表明模型较可靠，不存在过拟合现象。总的来说，模型验证有效，结果可用于不同香型烤烟模块游离氨基酸的鉴别分析。

2.2.2  不同香型烤烟模块游离氨基酸特征指标筛选  图5为OPLS-DA模型中游离氨基酸各指标的VIP图。VIP值越大，说明与香型差异的相关性越高，对解释变量的贡献率越大。以VIP值大于1作为具有显著贡献变量的筛选标准。由图5可以看出，有4个游离氨基酸指标对变量解释的贡献率较大（VIP>1），按照贡献率由大到小的顺序排列分别为缬氨酸（Val）、丙氨酸（Ala）、异亮氨酸（Ile）和天冬氨酸（Asp）。结合表1数据可知，天冬氨酸（Asp）和丙氨酸（Ala）含量在不同香型间存在显著性差异，可作为区分不同香型烤烟模块游离氨基酸的特征指标。

2.3  不同香型配打模块游离氨基酸特征指标验证

使用主成分分析对21种游离氨基酸组分进行降维处理，得到不同香型配打模块前2个主成分的得分散点图（图6）。其中清香型和中间香型烤烟模块有重叠区域，但都有一定的分散倾向；浓香型烤烟模块与其他两模块间区别显著。图7为各主成分可解释变异图，从中可看出PC1>PC2>PC3>PC4，其中PC1和PC2的方差贡献率分别为81.8%、8.6%，累计方差贡献率达到90.4%，因此选取PC1、PC2分析样本具有较好的可靠性。SVM模型依据前2个主成分，并将样本随机分为70%训练集和30%测试集，采用线性核函数“linear”，其SVM模型判别率达到86.36%（图8），认为这21种游离氨基酸组分能够用于判定不同香型烤烟模块。

应用丙氨酸和天冬氨酸建立SVM模型，并从样本中随机挑选70%组合构成训练集，挑选30%构成测试集，观察预测结果。结果表明SVM模型在线性核函数“radial”下，判别准确率为90.91% （图9），认为丙氨酸和天冬氨酸2个特征指标可用于区分不同香型烤烟配打模块，且其判别准确率高于应用21种氨基酸进行的判别。

3  讨  论

游离氨基酸是蛋白质代谢的重要中间产物，是影响烟叶品质的重要含氮化合物之一。本研究中，游离氨基酸总量表现为浓香型烤烟模块＞中间香型烤烟模块＞清香型烤烟模块，这与贾国涛等研究结果一致。相关研究表明，谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、甘氨酸（Gly）和苯丙氨酸（Phe），约占总游离氨基酸含量的70%，且浓香型烤烟中脯氨酸（Pro）、天冬酰胺（Asn）含量较高，与本研究结果基本相同。

本研究通过OPLS-DA建模，有效地从21种游离氨基酸中筛选出4种香型VIP值大于1的4个组分，结合差异显著性分析，确定丙氨酸（Ala）和天冬氨酸（Asp）2个特征指标。本文以21种游离氨基酸建立了清香型、中间香型和浓香型配打模块烟叶的SVM分类判别模型，对不同香型的判别正确率为86.36%；而应用上述确定的2个游离氨基酸特征指标构建的SVM模型判别准确率为90.91%，高于应用21种氨基酸建立的模型。因此不同配打模块烟叶香型可以主要依据丙氨酸（Ala）和天冬氨酸（Asp）的含量来进行判别，从而大大减少需要测定的指标数量。郭东锋等和李超等研究样品量较大，彼此所提的表征指标差别很大，且均采用单一方法建模，本研究先通过OPLS-DA实现样品的差异鉴别，同时获得样品差异的特征指标，再通过SVM算法验证指标的合理性，其结果为简化配打模块香型分类提供理论依据，实现了不同香型配打模块快速、准确的判别分类。

4  结  论

对不同香型的烤烟配打模块中游离氨基酸组分进行OPLS-DA分析，结合差异显著性分析筛选出2個特征指标丙氨酸（Ala）和天冬氨酸（Asp）。以其建立的SVM模型对不同香型的判别正确率为90.91%，高于以21种氨基酸主成分建立的SVM模型（86.36%），可以作为区分不同香型配打模块的特征物质，具有在工业企业推广应用的潜在价值。

参考文献

[1]周冀衡，杨虹琦，林桂华，等. 不同烤烟产区烟叶中主要挥发性香气物质的研究[J]. 湖南农业大学学报（自然科学版），2004，（1）：20-23.

ZHOU J H， YANG H Q， LIN G H， et al. Studies on tobacco's main volatile aroma components from different flue-cured tobacco production regions[J]. Journal of Hunan Agricultural University （Natural Sciences）， 2004， 30（1）： 20-23.

[2]郭东锋，胡海洲，汪季涛，等. 基于随机森林的烤烟香型分类研究[J]. 中国农学通报，2015，31（6）：241-246.

GUO D F， HU H Z， WANG J T， et al. Study on the classification of flue-cured tobacco based on the random forest algorithm[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2015， 31（6）： 241-246.

[3]邱昌桂，孔兰芬，杨式华，等. 基于GA-SVM算法的烤烟香型自动识别研究[J]. 烟草科技，2019，52（2）：101-108.

QIU C G， KONG L F， YANG S H， et al. Automatic recognition of flavor types of flue-cured tobacco based on GA-SVM algorithm[J]. Tobacco Science & Technology， 2019， 52（2）： 101-108.

[4]李超，李娥賢，秦云华，等. 基于因子分析和Bayers判别的烤烟香型分类模型构建与验证[J]. 中国烟草科学，2016，37（3）：72-78.

LI C， LI E X， QIN Y H， et al. Construction and verification of classification model for flavor of flue-cured tobacco based on factor analysis and Bayes discriminant[J]. Chinese Tobacco Science， 2016， 37（3）： 72-78.

[5]赵田，史宏志，姬小明，等. 不同类型烟草游离氨基酸组成和含量的差异分析[J]. 中国烟草学报，2011，17（2）：13-17.

ZHAO T， SHI H Z， JI X M， et al. Difference in composition and content of free amino acids among various tobacco types[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2011， 17（2）： 13-17.

[6]寇明钰，汪长国，戴亚，等. 不同产地和等级的雪茄烟叶中游离氨基酸含量分析[J]. 西南农业学报，2013，26（3）：963-967.

KOU M Y， WANG C G， DAI Y， et al. Analysis on free amino in cigar tobacco of different habitats and grades[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences， 2013， 26（3）： 963-967.

[7]徐磊，刘伟，过伟民，等. 烤烟游离氨基酸组分与感官品质的相关分析[J]. 烟草科技，2020，53（10）：21-31.

XU L， LIU W， GUO W M， e t al. Correlation analysis of free amino acid components and sensory quality of flue-cured tobacco[J]. Tobacco Science &Technology， 2020， 53（10）： 21- 31.

[8]邓国宾，曾晓鹰，薛红芬，等. 烤烟游离氨基酸与感官质量的相关性研究[J]. 中国烟草科学，2011，32（5）：14-19，23.

DENG G B， ZENG X Y， XUE H F， et al. Correlation between free amino acids and sensory quality of flue-cured tobacco[J]. Chinese Tobacco Science， 2011， 32（5）： 14-19.

[9]过伟民，郭建华，董洪旭，等. 烤烟游离氨基酸与感官品质的关联及烘烤过程的变化规律研究[J]. 中国烟草学报，2018，24（6）：16-25.

GUO W M， GUO J H， DONG H X， et al. Correlation between free amino acids and smoking quality of flue-cured tobacco and variations during flue-curing process[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2018， 24（6）： 16-25.

[10]孙晓伟，赵铭钦，翟欣，等. 不同海拔烤烟游离氨基酸含量变化及其与感官质量关系[J]. 西南农业学报，2014，27（5）：1912-1918.

SUN X W， ZHAO M Q， QU X， et al. Free amino acid content of flue-cured tobacco and its relationship with sensory evaluation at different altitudes[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences， 2014， 27（5）： 1912-1918.

[11]彭振兴，郭东锋，姚忠达，等. 典型烤烟区域氨基酸含量差异分析[J]. 安徽农业科学，2021，49（1）：176-180，185.

PENG Z X， GUO D F， YAO Z D， et al. Analysis of amino acid content difference in typical flue-cured tobacco regions[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences， 2021， 49（1）： 176-180， 185.

[12]YC/T 282—2009 烟叶游离氨基酸的测定氨基酸分析仪法[S].

YC/T 282—2009 Determination of dissociated amino acids in tobacco leaves-Amino acids analyzer method[S].

[13]賈国涛，张俊岭，魏壮状，等. 基于因子分析和聚类分析的烤烟游离氨基酸含量区域特征研究[J]. 作物杂志，2022（5）：208-214.

JIA G T， ZHANG J L， WEI Z Z， et al. Research on the regional characteristics of contents of free amino acids in flue-cured tobacco based on factor analysis and cluster analysis[J]. Crops， 2022（5）： 208-214.

[14]黄茹，吴玉萍，夏振远，等.氮素水平对红花大金元烟叶游离氨基酸和蛋白质含量的影响[J]. 中国烟草科学，2017，38（5）：50-55.

HUANG R， WU Y P， XIA Z Y， et al. Effect of nitrogen level on free amino acid and protein contents of Honghuadajinyuan tobacco leaves[J]. Chinese Tobacco Science， 2017， 38（5）： 50-55.

[15]史宏志，韩锦峰，刘国顺，等. 不同氮素营养的烟叶氨基酸含量与香吃味品质的关系. 河南农业大学学报，1997，31（4）：319-322.

SHI H Z， HAN J F， LIU G S， et al. The relationship of amino acid content in flue-cured tobacco leaf to flavor quality under different conditions of nitrogen nutrition[J]. Journal of Henan Agricultural University， 1997， 31（4）： 319-322.

[16]程昌合，解莹莹，王雪丽，等. 不同香型烤烟游离氨基酸组成和含量的差异分析[J]. 江西农业学报，2014，26（5）：84-86，90.

CHENG C H， XIE Y Y， WANG X L， et al. Analysis of difference in free amino acid composition and content of different flavor-type flue-cured tobacco[J]. Acta Agriculturae Jiangxi， 2014， 26（5）： 84-86， 90.

[17]袁帅，董洪旭，徐磊，等. 我国烤烟游离氨基酸含量区域分布研究[J]. 安徽农业科学，2020，48（13）：29-33.

YUAN S， DONG H X， XU L， et al. Regional distribution of free amino acid contents in flue-cured tobacco in China[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences， 2020， 48（13）： 29-33.