江苏中烟核心原料产区烤烟品种遗传分析及分子身份证构建

田震 李媛 孙晋浩 任民 李少鹏 张兴伟 赵才能 钱建财 刘国祥

摘  要：烟叶原料的稳定性、一致性是保障烟草工业公司产品高质量发展的关键，有效区分和鉴别烟叶原料是当前工业公司亟需解决的难点。本研究以江苏中烟核心原料产区主栽的23个烤烟品种为材料，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，从212对SSR引物中最终筛选出12对多态性高且条带清晰的引物，等位基因数介于2～5，多态性信息含量介于0.333 8～0.571 1。聚类分析发现，各品种按照遗传背景聚为4类；群体遗传结构和主成分分析均将供试材料划分为2个亚群，且类群内各品种的分布结果高度一致，与种质亲缘关系吻合度较高。该组引物高效可靠，可用于烤烟品种的DNA指纹图谱构建和遗传多样性分析。本研究可为江苏中烟核心产区主栽烤烟品种的育种利用和烟叶原料鉴定提供理论依据。

关键词：烤烟；SSR分子标记；遗传多样性；指紋图谱

中图分类号：S572.037                     文献标识码：A                      文章编号：1007-5119（2023）05-0001-08

Genetic Analysis and Molecular ID Card Construction of Flue-cured Tobacco Varieties in the Core Production Areas of China Tobacco Jiangsu Industrial Corporation

TIAN Zhen， LI Yuan， SUN Jinhao， REN Min， LI Shaopeng， ZHANG Xingwei，

ZHAO Caineng， QIAN Jiancai， LIU Guoxiang

（1. China Tobacco Jiangsu Industrial Co.， Ltd.， Nanjing 210019， China; 2. Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China）

 The stability and consistency of tobacco leaf raw materials are key for ensuring the high-quality development of tobacco industrial companies’ products. Effective differentiation and identification of tobacco leaf raw materials is an urgent challenge that industrial companies need to solve. In this study， 23 flue-cured tobacco varieties mainly planted in the production areas of Tobacco Jiangsu Industrial Corporation were used as materials. Eventually， 12 pairs of primers with high polymorphism and clear bands were selected from 212 pairs of SSR primers by polyacrylamide gel electrophoresis detection. The number of alleles ranged from 2 to 5， and the polymorphism information content ranged from 0.333 8 to 0.571 1. Cluster analysis revealed that each variety was clustered into four categories based on genetic background. Based on the population genetic structure and principal component analysis the tested materials were divided into two subgroups. The distribution results of varieties within the groups were highly consistent， and were largely agreed with the pedigree relationship. This set of primers was highly efficient and reliable， and it could be used for constructing DNA fingerprints and genetic diversity analysis of flue-cured tobacco varieties. The results from this study could provide theoretical basis for the breeding utilization and identification of tobacco leaf materials of main flue-cured tobacco varieties in the Tobacco Jiangsu Industrial Corporation core production areas.

 flue-cured tobacco; SSR molecular marker; genetic diversity; fingerprint spectrum library

基金项目：中国烟草总公司重大科技项目（110202201014）；江苏中烟工业有限责任公司科技项目（202208）；中国农业科学院科技创新工程（ASTIP-TRIC01）；山东省自然科学基金面上项目（ZR2022MC145）

作者简介：田  震（1988-），硕士，农艺师，主要从事烟叶原料和卷烟配方研究。E-mail：tianzhen@jszygs.com。*通信作者，E-mail：liuguoxiang@caas.cn

收稿日期：2023-05-26                 修回日期：2023-09-25

烟草在我国国民经济中占有重要地位，优良品种真实性和纯度直接影响到产品的质量，是突出烟叶风格，保障中式卷烟品质的基础。而烟叶原料的稳定性、一致性是保障工业公司产品高质量发展的关键。卷烟生产涉及烟叶种植、调制、收购、调拨等多个环节，近年来由于部分产区品种布局落实不到位，导致在烟叶采收和调拨环节易发生品种混杂和混淆等问题，通过田间农艺性状、烟叶外观和抽样感官评价等传统鉴别方法难以对烟草品种进行精准的区分和鉴定。因此，如何高效、准确、有针对性地鉴别烟叶品种成为当前亟需解决的问题。

相较于传统的烟草品种鉴别方法，利用分子标记进行鉴定可不受环境影响且准确度更高。DNA指纹图谱具有多位点性、高变异性和简单稳定的遗传性，利用分子标记构建DNA指纹图谱进行品种真伪鉴定已广泛应用到作物品种保护中，国际植物品种权保护联盟（UPOV）将构建DNA指纹数据库的标记方法确定为SSR和SNP。其中SSR标记多态性高、专一性强、结果可靠、操作简单。以Bindler等公布的烟草高密度SSR标记遗传图谱为基础的DNA分子鉴定方法，目前在烟草领域应用最为广泛。为了能够快速鉴定烤烟主栽品种，黄莉莎等筛选出4对SSR引物，能将9个烟草主栽品种完全区分开；孙九喆等利用琼脂糖凝胶电泳筛选出5对SSR引物，构建了11个主要烟草品种的指纹图谱；田阳阳等利用SSR荧光标记和毛细管电泳检测技术确定了5对SSR引物，能够有效地将8个烤烟主栽品种区分开。

系统掌握核心产区烟叶品种、深入挖掘种质资源遗传信息，对进一步明确工业公司原料基地烟叶需求品种和保障烟叶原料的优质、稳定具有重要意义。本研究以江苏中烟核心原料产区主栽的23个烤烟品种为样本，筛选出一套多态性高、重复性好的SSR引物，对供试品种进行遗传多样性分析并构建DNA指纹图谱，建立江苏中烟核心原料产区烤烟品种分子身份证，以期为烟叶原料的科学、准确鉴定提供技术支持。

1  材料与方法

1.1  试验材料

根据江苏中烟核心原料产区2022年度烟叶种植和品种试验安排，调研基地所在植烟县内其他主栽品种和试验品种，同时结合国家烟草种质资源中期库中现有资源情况，最终选定23个烤烟品种进行分子身份证构建。所有供试品种由国家烟草种质资源中期库（青岛）提供，品种资源的编号、名称、来源及系谱见表1。

1.2  DNA提取

供试材料于2022年种植于中国农业科学院烟草研究所的人工气候室，于苗期采集嫩叶于2 mL离心管中，经液氮冷冻后研磨，采用SLS法提取DNA，将DNA浓度统一稀释到50 ng/μL后于–20 ℃保存备用。

1.3  SSR引物

参考本实验室前期建立的SSR引物数据库和其他已发表的多态性较好的SSR引物，筛选出212对SSR引物用于后续试验。

1.4  PCR扩增及电泳检测

扩增体系及反应程序参照2×Taq PCR MasterMix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）说明书。PCR扩增产物在8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，银染后观察并记录数据。

1.5  数据分析和指纹图谱构建

聚类分析、主成分分析和群体结构分析参考向小華等方法：用DataFormater将读取的“0，1”数据进行矩阵转换；用Popgene32软件计算观察等位基因数（Observed number of alleles）、有效等位基因（Effective number of alleles）等；利用PowerMarker 3.25软件计算多态信息量（Polymorphic Information Content，简称PIC）；利用NTSYS-PC 2.10软件采用类平均法（UPGMA）进行聚类分析和主成分分析（PCA）；利用Structure2.3.4软件进行群体遗传结构分析。根据12对SSR引物的扩增结果，参考王琰琰等指纹图谱构建方法，建立江苏中烟核心产区品种资源分子身份证。

2  结  果

2.1  SSR引物筛选

以江苏中烟需求量大且亲缘关系较远的5个烤烟品种（云烟87、云烟99、红花大金元、CB-1和中烟100）为样本，利用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对212对引物进行初筛，其中有47对标记带型清晰且具有多态性，占筛选标记总数的22.17%；然后以江苏中烟核心产区主栽的23个烤烟品种（表1）为样本，对初选的47对标记进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，最终筛选出12个条带清晰、多态性高、易于读带的SSR标记。

2.2  遗传多样性分析

SSR引物在23份供试材料中共检测出37个基因位点（表2），平均等位基因数为3.083 3个。有效等位基因数在1.714 7～2.806 4之间，平均为2.104 0，有效等位基因所占比例为68.24%。观测杂合度的变化范围为0.342 0～0.573 9；群体平均Shannon’s遗传多样性指数和Nei’s多样性指数分别为0.843 3和0.513 1；期望杂合度的平均值为0.524 5；引物的多态性信息含量在0.333 8～0.571 1之间，平均值为0.433 3，其中PT52358的PIC值最大，表明具有较高的鉴别能力（图1）。

2.3  参试种质的聚类分析

聚类分析结果表明（图2），除云烟87和云烟301、云烟116和湘烟3号及湘烟5号外，利用SSR标记可以将剩余烤烟品种相互区分开。当遗传相似系数为0.46时，可将供试品种分为4个类群。第I类包括云烟87、云烟301、云烟116等10个品种，均具有K326的遗传背景；第II类包括云烟105、延安1号、LY1306等7个品种，遗传背景较为丰富；第III类包括云烟99、云烟100、中川208等5个品种，遗传背景主要为K326和红花大金元；第IV类仅包含CB-1这1个品种。

2.4  主成分分析及遗传结构分析

分别利用NTSYS软件和Structure软件对供试品种进行主成分分析（图3）和群体遗传结构分析（图4），结果表明，两种分析方法均将23个烤烟品种划分为2个类群，除湘烟6号外，其他品种在2种方式下的分类结果相同。其中，主成分分析中的类群I和遗传结构分析中的类群1（红色部分）均具有K326的遗传背景，并且在聚类图中也聚为一个分支；主成分分析中的类群II和遗传结构分析中的类群2遗传背景较为多样化，且涵盖了聚类分析中的II、III、IV。

2.5  DNA指纹图谱及二维码的构建

根据12对SSR引物的扩增结果构建了23个烤烟品种的指纹图谱和二维码（表3）。在进行烟叶品种鉴别时，可利用12对SSR标记的扩增结果与已有指纹图谱进行比对，位点差异在1个及以上的认定为不同品种。通过该方法可确认烟草公司调拨的烟叶品种是否准确，是否存在品种混杂问题。

3  讨  论

作物种质资源是支撑农业科技创新和作物遗传育种的物质基础，2023年中央一号文件明确把种质资源精准鉴定评价列为重点工作，要求加快构建开放协作、共享应用的种质资源精准鉴定评价机制。水稻、玉米、大麦、高粱、陆地棉以及小麦等13种农作物已经制定了SSR分子标记法的品种鉴定技术规程农业行业标准。但目前为止，烟草还未制定SSR标记法品种鉴定技术规程。前人对于我国主栽烤烟品种分子鉴定研究中的供试材料数量普遍较少，随着我国烤烟新品种选育工作的不断推进，用于实际生产的品种范围也在不断扩大，原有鉴定引物已无法进行有效区分。因此，本试验结合江苏中烟的实际烟叶收购情况，将供试品种扩大到23个，以前人已发表的研究结果为基础，扩大引物筛选范围，最终从212对SSR引物中筛选出12对用于DNA指纹图谱构建。引物筛选结果表明，多数前人筛选出来的引物应用于本试验时多态性较低，无法进行有效区分，一方面可能与供试种质的亲缘关系有关，另一方面可能与SSR标记的检测方法有关。此外，本研究根据江苏中烟2022年烟叶种植情况选取了23个品种进行试验，后续将根据江苏中烟原料需求及实际种植情况，不断更新完善DNA指纹图谱，保障烟叶品种鉴定顺利进行。

我国主栽烤烟品种大多直接或者间接来源于G28、K326、红花大金元和NC82等，存在親本过度集中、亲缘关系较近等问题，容易造成同一生态区内品种抗性降低。本研究UPGMA聚类分析结果显示了与之相似的规律：遗传背景相似的品种大都聚在一起。其中云烟87和云烟116的遗传距离较近，这与丁永亮等和轩贝贝等的结果一致；CB-1与其他品种的遗传距离最远，这与田阳阳等研究结果一致。但是在轩贝贝等研究结果中，云烟87与K326首先聚在一起，遗传相似系数高达0.9，但在本研究中，二者虽都位于第I类群，但聚类到了不同分支上，这可能与供试材料和SSR标记的不同有关。群体遗传结构和PCA主成分分析均将供试材料划分为2个亚群，且类群内具体品种的分布结果高度一致；3种分析方法中类群I所包含的品种相同，均具有K326遗传背景，说明烟草种质间的遗传差异与其亲本来源密切相关，此结果与前人在分子水平上对烤烟品种资源的研究相吻合 。本研究中所选的12对引物可以清楚地检测出供试品种的遗传多样性，类群划分真实反映了供试材料的群体结构和亲缘关系，说明该组引物高效可靠，适用于烤烟品种资源鉴定和遗传多样性分析。

我国栽培烟草品种间亲缘关系较近、形态相似程度高，找到有效鉴定引物是品种区分的关键。在本研究中，云烟87和云烟301没有区分开，原因可能是云烟301是云烟87通过定向改良技术选育的抗PVY新品种，二者遗传背景高度一致；云烟116、湘烟3号和湘烟5号也没有区分开，这3个品种都具有K326的亲本来源，遗传背景比较狭窄。本研究开发的分子标记仅分布于9条染色体上，而且分布不均匀；因此，下一步将扩大引物筛选范围，最终形成一套在染色体上分布均匀、多态性信息含量高的核心引物组，确保每一个品种有唯一分子身份证。

核心产区烟叶原料的稳定性、一致性是保障工业公司产品高质量发展的关键所在。如何高效率地对烟叶原料进行准确鉴定，是当前工业公司亟需解决的难点。本研究基于聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，筛选出一套SSR引物集，构建了江苏中烟核心原料产区主栽品种独有的DNA指纹图谱，为烟叶原料分子鉴定提供了数据支撑。下一步将以此为基础，构建调拨烟叶品种鉴别技术体系，并利用该技术体系完成江苏中烟核心产区调拨烟叶品种鉴定工作，确认调拨烟叶品种是否准确，是否存在品种混杂的问题。实现从田间管理到收购采样，全流程跟踪、鉴定核心产区原料，保障烟叶原料质量的稳定性和可靠性。

4  结  论

本研究以江苏中烟核心产区主栽的23个烤烟品种为材料，从212对SSR引物中最终筛选出12对多态性高且条带清晰的引物。聚类分析、群体遗传结构和主成分分析真实反映了供试材料的亲缘关系和群体结构，说明该组引物高效可靠，可用于烤烟品种的DNA指纹图谱构建和遗传多样性分析。本研究结果可为江苏中烟核心产区主栽烤烟品种的烟叶原料鉴定提供理论依据，保障烟叶原料质量的稳定性、可靠性，为工业公司产品高质量发展奠定基础。

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