广西烟草炭疽病病原鉴定及生物学特性研究

石洁 桑维钧 卢燕回 张得平 孔菲 首安发 杨茂发

摘  要：為明确广西壮族自治区贺州市钟山县发生的真菌性叶斑病害的病原菌种类和生物学特性，分别采用组织分离法和活体伤口接种法对病原菌进行分离和致病性测定，利用PCR扩增病原菌核糖体内转录间隔区（）、肌动蛋白（）和几丁质合成酶（）进行分子鉴定，结合形态学特征对病原菌种类进行鉴定，采用菌丝生长速率法测定病原菌生物学特性。聚类分析结果表明，病原菌与平头炭疽（）聚为一支，且支持率为100%，结合形态学特征，将病原菌鉴定为平头炭疽（），这是平头炭疽寄生烟草引起烟草炭疽病的首次报道。病原菌生物学特性测定结果表明，病原菌对环境有较强的适应性，最适培养基为营养琼脂（NA），最适温度30 ℃，最适光照条件为全黑暗，最适碳源为淀粉，最适氮源为蛋白胨，pH为7时病原菌生长最快，病原菌致死温度为53 ℃、10 min。研究结果为病害的及时准确防治和深入研究提供了理论依据。

关键词：烟草；炭疽病；病原菌鉴定；多基因分子鉴定；生物学特性

中图分类号：S435.72                       文献标识码：A                      文章编号：1007-5119（2023）05-0070-09

Identification of Tobacco Anthracnose Pathogen and its Biological Characteristics in Guangxi

SHI Jie， SANG Weijun， LU Yanhui， ZHANG Deping， KONG Fei， SHOU Anfa， YANG Maofa

（1. School of Tobacco， Guizhou University， Guiyang 550025， China; 2. Science and Technology Department， Guangxi Zhuang Autonomous Region Company， China National Tobacco Corporation， Nanning 530022， China; 3. Hezhou Branch， Guangxi Zhuang Autonomous Region Tobacco Company， Hezhou， Guangxi 542800， China）

 Aiming to clarify the species and biological characteristics of pathogenic fungal leaf spot diseases in Zhongshan County， Hezhou City， Guangxi Zhuang Autonomous Region， the pathogenic fungi were isolated by tissue isolation and its pathogenicity was determined by inoculation of living wounds. The molecular identification of pathogenic fungi was performed by PCR amplification of their internal transcribed spacer region of the ribosomes （）， actin （）， and chitin synthase （）. The pathogen species were identified by combining morphological characteristics， and mycelial growth rate method was employed to determine the biological characteristics of pathogens. Results of cluster analysis showed that the pathogen and  were clustered into one team， and the support rate reached 100%. Combined with morphological characteristics， the pathogen was identified as ， which is the first report of tobacco anthracnose caused by  parasitising tobacco. The determination of pathogen’s biological characteristics showed that the pathogen exhibited strong adaptability to environment. The optimal medium， temperature， light condition， carbon source， nitrogen source was nutrient agar （NA）， 30 ℃， total darkness， starch， peptone， respectively. The most rapid growth of pathogen was observed at pH 7， and the lethal temperature of pathogen was 53 ℃ for 10 min. The results of the study present the diversity of pathogens causing tobacco anthracnose， and provide a theoretical basis for the timely accurate control and further research of the disease.

 tobacco; anthracnose; pathogen identification; multigene molecular identification; biological characteristics

基金项目：中国烟草总公司广西壮族自治区公司项目（202145000024006）

作者简介：石  洁（1999-），女，在读硕士，主要从事烟草病原真菌学研究。E-mail：18285601559@139.com

*通信作者。E-mail：桑维钧，984139246@qq.com；卢燕回，29994267@qq.com

收稿日期：2023-04-03                  修回日期：2023-10-10

烟草是我国重要的经济作物之一，对增加國家财政税收具有重要意义。病害的发生限制着其产质量，截至目前，我国共有70多种烟草病害，因烟草病害造成的损失常年达10%左右，此外，烟草种植年限的增加、连作以及气候变化等因素为新病害的发生提供了有利的条件，越来越多的新病害被报

道，四年内，我国发现鉴定新病害20多种，并且还有不断上升的趋势。2022年，广西壮族自治区贺州市钟山县大田烟株发生一种叶部病害，症状不同于其他已报道的病害，其病斑较大，形状不规则或近圆形，有轮纹，中间白色至淡黄褐色，且着生有较密集的黑点，边缘深褐色，发病率达16%左右，对当地烟草产质量有较大的影响。为明确该病害的种类，对其病原菌进行分离鉴定，同时测定该病原菌的生物学特性，旨在明确病害发生规律进而为精准防治提供参考依据。

1  材料与方法

1.1  供试材料

1.1.1  供试样品  2022年7月，从广西壮族自治区贺州市钟山县种植的烟草品种“K326”上采集到一片有典型病斑的烟叶。

1.1.2  供试培养基  供试培养基包括采购自青岛海博生物技术有限公司的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）、玉米粉琼脂（CMA）、麦芽汁琼脂（MEA）和察氏琼脂（CDA），采购自上海博微生物科技有限公司的高氏合成1号琼脂（GSA）、营养琼脂（NA）和溶菌肉汤（LB），采购自北京索莱宝科技有限公司的燕麦琼脂（OA）以及自配的水琼脂（WA：琼脂粉20 g，蒸馏水1000 mL）、烟叶煎汁琼脂（TA：新鲜烟叶200 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1000 mL）、松针琼脂（PNA：新鲜松针叶200 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1000 mL）、胡萝卜琼脂（CA：胡萝卜200 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1000 mL）、V8果汁琼脂（V8：V8果汁100 mL、碳酸钙0.02 g、蒸馏水1000 mL）共13种。

1.2  病原菌的分离、纯化

采用组织分离法分离病原菌，将病健交接处剪切成5 mm×5 mm的组织块，用75%酒精消毒30 s，5%的次氯酸钠溶液消毒3 min，无菌水冲洗4次，用无菌滤纸吸干水分后接种在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）上，28 ℃恒温黑暗培养5 d，单孢纯化4次，挑取单一菌落于PDA上培养，5 d后转于40%甘油中，于–20 ℃冰箱保存。

1.3  病原菌致病性的测定

选取健康的“云烟87”烟株，采用活体伤口接种法，用75%酒精和无菌水消毒洗净烟叶，用无菌注射器在叶片上随机穿刺6个小孔作为接种处，用无菌打孔器（=5 mm）在生长5～7 d的菌落边缘打孔获取菌块，菌块覆盖于接种处，有菌丝的一面朝下，菌块上覆盖湿润的棉球保湿；无菌PDA培养基块（=5 mm）作为对照。接种叶片用自封袋保湿、隔绝污染，置于28 ℃培养箱，保持培养箱湿度80%以上，2 d后取走菌饼，定期观察烟叶发病情况，接种烟叶发病后根据1.2方法再次分离病原菌株。

1.4  病原菌鉴定

1.4.1  形态学鉴定  观察分生孢子盘及分生孢子的形态特征并测量分生孢子的大小。病原菌接种至PDA平板上，28 ℃培养5 d，观察菌落培养性状（包括菌落形状、颜色和质地）。挑取菌丝体制作玻片，在光学显微镜下观察病原菌菌丝形态特征。

1.4.2  分子生物学鉴定  将病原菌接种于覆有半透膜的PDA平板上，5 d后用无菌手术刀刮取约50 mg菌丝，按照真菌DNA提取试剂盒的步骤提取DNA，使用引物（表1）对病原菌对应位点序列进行扩增，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，反应体系和扩增条件参考石妞妞等的方法，PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测后委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。基因序列经BLAST比对分析后，提交至NCBI获得登录号。从GenBank中收集已知的其他相关病原菌的序列信息（表2），通过MAFFT V.7（https：//mafft.cbrc.jp/alignment/software/）建树，建树方法采用邻接法（neighbor-joining），Boot-strap值设为1000来检验系统发育树的可靠性。

1.5  病原菌的生物学特性测定

1.5.1  不同培养基对病原菌菌丝生长的影响  用无菌打孔器（=5 mm）在生长5 d的菌落边缘打孔获取菌饼，将菌饼有菌丝的一面接种于13种不同培养基平板上，置于28 ℃恒温黑暗培养箱中培养。每个处理3个重复，5 d后采用十字交叉法测量菌落直径。

1.5.2  不同温度对病原菌菌丝生长的影响  获取菌饼的方法同1.5.1，将菌饼接种于PDA平板上，放置于5、10、15、20、25、30、35 ℃的恒温黑暗培养箱中培养。

1.5.3  不同光照条件对病原菌菌丝生长的影响  获取菌饼的方法同1.5.1，将菌饼接种于PDA平板上，分别置于全光照、全黑暗、12 h光暗交替3种光照条件的培养箱中恒温培养。

1.5.4  不同碳源对病原菌菌丝生长的影响  以察氏瓊脂为基础培养基，蔗糖作为碳源，并用等碳量的木糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖、果糖、山梨糖醇和可溶性淀粉代替蔗糖，制备含有不同碳源的培养基，后将菌饼接种于含不同碳源的培养基平板上，置于28 ℃恒温黑暗培养箱中培养。

1.5.5  不同氮源对病原菌菌丝生长的影响  以察氏琼脂为基础培养基，以硝酸钠为氮源，用等氮量的蛋白胨、牛肉浸粉、氯化铵、尿素、甘氨酸、硫酸铵、赖氨酸、精氨酸、苯丙氨酸和酵母浸粉代替硝酸钠，制备含有不同氮源的培养基，参考1.5.1获取菌饼后，将菌饼接种于含有不同氮源的培养基平板上，置于28 ℃恒温黑暗培养箱中培养。

1.5.6  不同pH对病原菌菌丝生长的影响  以PDA为基础培养基，在无菌操作台内用1% HCL和1% NaOH调节灭菌PDA的pH，使之分别为4、5、6、7、8、9、10和11，参考1.5.1获取菌饼后，将菌饼接种于不同pH的培养基平板上，置于28 ℃恒温黑暗培养箱中培养。

1.5.7  病原菌致死温度的测定  用无菌打孔器打取直径为5 mm的菌饼，放置于装有1 mL无菌水的离心管中（容量1.5 mL），封口膜封口后分别置于35、40、45、50、55、60、65、70、75 ℃的恒温水浴锅中处理10 min，取出后放置于–20 ℃冰箱迅速降温，处理后的菌饼接种于PDA平板上，放置于28 ℃恒温黑暗培养箱中培养，5 d后确定致死温度的大致范围，然后以1 ℃为梯度递增，最终确定病原菌的致死温度。

1.6  统计分析

运用Excel 2010求取试验数据的平均值、标准偏差，构建柱形图，采用SPSS Statistics 26的Duncan’s新复极差法进行单因素方差分析（One-way ANOVA）。

2  结  果

2.1  病害田间症状及菌株致病性的测定

如图1A所示，病斑不规则或近圆形，有轮纹，中间白色至淡黄褐色，且着生较密集黑点，靠近边缘处呈深褐色。采用组织分离法分离菌株，后经纯化获得一株单孢菌株，命名为GAXF2。利用活体伤口接种法接种菌株，2 d后取走菌饼，接种后第9天，烟叶接种点有明显病斑，呈褐色，周围有黄色晕圈（图1B），发病烟叶的组织明显变薄，韧性变差。回接得到的病叶再次制片镜检，观察到大量的分生孢子，并分离获得与病株初分离物菌落形态相同的真菌菌株，根据科赫氏法则，证实该菌为此次导致烟草发生叶斑病的病原菌。

2.2  病原菌培养性状及显微形态特征

病原菌在PDA培养基上培养5 d后，菌落平均直径为33 mm，菌落呈圆形。生长初期，菌落气生菌丝淡黄色，生长后期，部分菌落的气生菌丝逐渐由淡黄色变为橘色至橄榄绿、黑褐色，另外一部分菌落的气生菌丝始终为淡黄色，前者易产孢而后者不产孢。菌落质地稍平伏状，有短绒毛，边缘锯齿状、圆齿状或波浪状（图2A-C），菌落气生菌丝颜色以及边缘形状均与MAYONJO等描述的平头炭疽（）培养性状一致。显微镜下观察，分生孢子单孢，无隔膜，透明，光滑，无油球，平均大小（7.8～12.9）×（2.2～3.5）µm，镰刀形，为弯孢型（图2D），区别于其他5种已报道的烟草炭疽病直孢型病原菌；菌丝粗细不一，部分有隔膜（图2E）；有典型的炭疽菌显微形态特征，即橙黄色的载孢体-分生孢子盘，其上着生刚毛，褐色或深褐色，钉子状，有4～6个横隔（图2F-G）。

2.3  病原菌分子鉴定结果

利用、和基因片段扩增、测序，将测序结果提交至NCBI进行Blast对比分析，结果显示与平头炭疽（）相似度高达99%～100%，测序结果上传至GenBank，获取登录号（：OP484886；：OP620430；：OP620436）。从GenBank中下载同属不同种、同属同种以及不同种不同属的菌株、、和序列构建系统发育树，结果显示（图3-5），GAXF2菌株与聚为一支，且支持率100%，证实广西烟草炭疽病的病原菌为。

2.4  病原菌生物学特性

2.4.1  不同培养基对病原菌菌丝生长的影响  如图6所示，最适合GAXF2菌株生长的培养基为NA，菌落平均直径达52.83 mm，且与其他处理差异显著（<0.05），CA也有利于该病原菌生长，平均直径为48.33 mm。MEA、V8和OA也为病原菌提供了适宜生长的环境，三者间的菌落直径差异不显著；而WA、CDA、PDA和PNA不利于病原菌生长。

2.4.2  温度对病原菌菌丝生长的影响  如图7所示，GAXF2菌株在10～35 ℃均能生长。从10 ℃到30℃，病原菌生长速度随温度升高而升高，在30 ℃温度条件下生长最快，平均直径达29.00 mm，其次分别是28 ℃和25 ℃，平均直径为28.33 mm和26.50 mm，这3种温度条件下的菌落直径与其他温度处理差异显著。35 ℃温度条件下，病原菌生长速度减缓，且从2～3 d开始，菌落中心产生大量分生孢子盘。

2.4.3  光照条件对病原菌菌丝生长的影响  如图8所示，在3种光照条件下GAXF2菌株均能生长，全黑暗条件最适合病原菌生长，平均菌落直径达33 mm，菌丝颜色呈淡黄色，全光照和12 h光暗交替条件下菌丝均呈现橘色。

2.4.4  不同碳源对病原菌菌丝生长的影响  如图9所示，GAXF2菌株能利用多种碳源。淀粉作为碳源时最有利于菌落生长，菌落的平均直径达51.67 mm，显著高于其他碳源处理；麦芽糖和山梨糖作为碳源时，病原菌生长速度也较快，菌落直径分别达45.33 和45.00 mm，两种碳源处理差异不显著；最不适于病原菌生长的碳源为木糖，菌落平均直径仅22.33 mm，显著低于其他碳源处理。

2.4.5  不同氮源对病原菌菌丝生长的影响  如图10所示，GAXF2菌株可以利用多种氮源，蛋白胨、酵母粉和牛肉浸粉作为氮源时，菌落直径显著高于其他氮源处理，分别为51.83、51.67及51.00 mm，3种氮源处理间差异不显著；以尿素和精氨酸作为氮源时，菌落生长情况最差，菌落平均直径仅为25.83 mm和25.17 mm，显著低于其他氮源处理。

2.4.6  pH对病原菌菌丝生长的影响  如图11所示，GAXF2菌株在弱酸和弱碱环境中均能生长，pH为7时菌落平均直径最大，为38.83 mm，其次为pH 8时（38.17 mm），两个pH处理间差异不显著。pH为4时，菌落平均直径最小，为27.83 mm，显著低于其他处理。

2.4.7  病原菌致死温度的测定  35～50 ℃水浴加热10 min，GAXF2菌株皆存活，55 ℃水浴加热10 min，病原菌死亡，说明病原菌的致死温度在51～55 ℃之间。之后分别设51、52、53、54和55 ℃共5个温度梯度，结果显示菌株致死温度为53 ℃、10 min。

3  讨  论

炭疽菌属种类达600种，可侵染3200多种植物。研究发现，毁灭炭疽菌（）、煙草炭疽菌（）、黑线炭疽菌（）、胶胞炭疽菌（）和果生炭疽菌（）都能侵染烟草导致烟草炭疽病的发生。本研究采用形态学特征、分子生物学鉴定及科赫氏法则，明确了引起广西壮族自治区贺州市钟山县烟草炭疽病的病原菌为平头炭疽（），这是寄生烟草导致烟草炭疽病的首次报道。本研究结果丰富了烟草炭疽病病原菌的多样性，为烟草炭疽病的精准识别和防控提供了理论依据，有关平头炭疽菌对烟草炭疽病的致病机理还需进一步研究。

本研究结果显示，GAXF2菌株在13种不同的培养基上均能生长，在NA培养基生长直径最大，为最适培养基。该病原菌10～35 ℃均能生长，致死温度为53 ℃、10 min，有较强的温度适应能力。其中30 ℃时病原菌生长最快，这与孙志峰等研究结果一致。不同光照条件下菌落直径略有不同，全

黑暗条件最适病原菌菌丝生长，全光照和光暗交替有利于产孢。病原菌有广泛的碳氮源适应性，在供试的不同碳、氮源培养基中均能生长，淀粉和蛋白胨分别为最适的碳、氮源，以尿素作为氮源时，菌落生长情况不理想，以尿素作为氮肥时可能对引起的烟草炭疽病有一定的抑制作用。病原菌在弱酸至弱碱环境中均能生长，更适应于中性偏碱性的环境。

研究结果与分离自其他植物的同种病原的生物学特性差异较大，如分离自降香黄檀的平头炭疽菌株在全光照条件下菌丝生长更快，分离自四季秋海棠的平头炭疽最适碳源为葡萄糖，最适氮源为硝酸钠和甘氨酸，推测是因为其进化、变异或者地域环境、寄主差异导致。同时，病原菌在不同培养基、温度、光照、碳源、氮源和pH条件下均能生长，证明其有较强的环境适应性，有利于病原菌的传播，生产中应注意及时防治。

本研究仅采集广西壮族自治区一个区域的烟草炭疽病病样，有一定局限性，不能完全代表其他区域烟草炭疽病病原菌的种类，下一步工作拟增加采样地点，明确的传播繁育范围，以及由该病原菌导致炭疽病的发病率和病情指数，为烟叶生产中病害的精准防治提供理论依据。

4  结  论

本研究采用形态学特征结合分子鉴定，确定广西壮族自治区贺州市钟山县发生的真菌性叶斑病害病原菌为平头炭疽（，这是寄生烟草的首次报道。生物学特性测定结果表明，该病原菌有较强的适应性，适应于各种培养基、温度、光照条件、碳氮源以及pH，且在中性偏弱碱性，光照较弱且营养充足的环境下，生长速度更快。生产中，可以通过创造偏酸性的环境以及适当增加株行距以增大光照等方式，对引起的烟草炭疽病进行综合防控，降低该病害的发病率。

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