芪参颗粒调控ACE2-Ang(1-7)-Mas轴改善大鼠心力衰竭合并骨骼肌萎缩的作用及机制探讨❋

常 宏,高振安,张美沙,宿玮洁,王 萌,刘思宇,肖银军,唐徐浩,王 勇

(1.华北理工大学中医学院,河北唐山 063210;2.河北省中西医结合防治糖尿病及其并发症重点实验室,河北唐山 063210;3.北京中医药大学中医学院,北京 100029)

心力衰竭(heart failure,HF)是多种心脏疾病发展的终末阶段,全球HF患者接近2 600万,给医疗和经济造成沉重负担[1]。HF患者除了心脏受损,还有运动耐力降低,究其原因,不仅因为心功能低下,还跟骨骼肌萎缩密切相关[2]。骨骼肌萎缩在HF患者的早期阶段就已经出现[3],严重影响HF患者的生命质量和预后[4-5]。因此,在HF的治疗上,防治骨骼肌萎缩与改善心功能同等重要。

肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin aldosterone system, RAS)不仅能调控血压,还参与到多种疾病如充血性HF、慢性肾脏疾病、肿瘤等诱导的骨骼肌萎缩的病理发展中[6]。该系统作用的发挥主要包括两个途径:一是经典RAS途径,此途径主要靠血管紧张素(angiotensin,Ang )Ⅱ发挥作用,Ang Ⅱ能促进肌蛋白降解,导致骨骼肌萎缩[6];一是非经典RAS途径,该途径作用的发挥主要靠ACE2-Ang(1-7)-Mas轴。在血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)2的催化下,AngⅡ能转化为Ang(1-7),Ang (1-7)与其Mas受体(mas receptor,Mas R)结合,具备与Ang Ⅱ相反的效果,即抑制骨骼肌的萎缩[7]。

芪参颗粒是临床治疗HF的有效验方,研究发现该方能通过调控RAS发挥防治HF的作用[8],动物实验中还发现该方能改善HF大鼠游泳力竭时间(代表疲劳症状)和呼吸频率(代表气短症状)[9],这些发现提示该方可能对骨骼肌萎缩起到抑制作用。本研究通过建立HF合并骨骼肌萎缩模型,从ACE2-Ang(1-7)-Mas轴探讨芪参颗粒对HF合并骨骼肌萎缩的防治作用及相关机制。

1 材料

1.1 动物

正常雄性SD大鼠28只[体重(200±10)g,SPF级]购自北京华阜康有限公司,动物生产许可证号:SCXK(京)2020-0004。大鼠饲养于华北理工大学动物实验中心动物房,饲养环境为SPF级,温度(20～24 ℃),相对湿度(40%～60%),光照和黑暗12 h交换进行,普通饮食、饮水。

1.2 主要试剂和药品

大鼠N端脑利钠肽前体(n-terminal brain natriuretic peptide precursor, NT-pro BNP)ELISA检测试剂盒、Ang (1-7) ELISA检测试剂盒、Ang Ⅱ ELISA检测试剂盒均购自武汉华美生物工程有限公司,货号分别为CSB-E08752r、CSB-E14241r、CSB-E00494r;ACE2抗体、GAPDH抗体、MyHc 抗体均购自华安生物科技有限公司,货号分别为ET 1611-58、ET1601-4、ET1702-88;MasR抗体购自以色列Alomone Labs公司,货号AAR013AN1125;羊抗兔二抗购自北京普利莱基因技术有限公司,货号C1309;芪参颗粒冻干粉(黄芪、丹参、附子、玄参、金银花、甘草购自北京同仁堂股份有限公司,由北京中医药大学中药学院水提醇沉制备而成[10]);福辛普利钠片购自中美上海施贵宝制药有限公司,国药准字H19980197,规格10 mg/片。

1.3 主要仪器与设备

M200PRO型多功能酶标仪,瑞士TECAN集团公司;L-800R型台式低速大容量冷冻离心机,苏州江东精密仪器有限公司;BIO-RADLS-C50型蛋白凝胶成像系统,美国Bio-Rad公司;AUTOSTAINER XL型组织自动染色机、TP1020型组织脱水机、RM2245型切片机,上海徕卡生物系统有限公司;JK-TBP-3A型生物组织摊片机,上海精学科学仪器有限公司;DB-B2型烤片机,常州国华电器有限公司;A3型动物心电图机,珠海宏邦医疗科技有限公司;BX53型显微镜,日本Olympus公司。

2 方法

2.1 模型制备

根据已有实验技术基础[10-11],通过结扎大鼠左侧冠状动脉前降支,复制心梗后心衰模型。3 d后,通过心电图检测病理性Q波情况,若大鼠心电图12个导联中有6～8个导联出现病理性Q波,即被选择为造模成功[12]。

图1 大鼠心脏HE染色(×200)

2.2 分组和药物干预

根据心电图病理性Q波的多少和所在导联将造模成功后的大鼠随机分为模型组、芪参颗粒组和福辛普利组,每组7只。同时以假手术组作为对照。各组处理方法如下:假手术组(0.9%氯化钠溶液灌胃,1 mL/100 g/d),模型组处理同假手术组,芪参颗粒组(冻干粉水溶液灌胃,2.352 mg/kg/d),福辛普利组(药物水溶液灌胃,4 mg/kg/d),干预时间为12周。

2.3 标本采集及指标检测

2.3.1 左心室射血分数 腹腔麻醉大鼠,胸部备皮,进行超声心动图检测,每组选择5只大鼠,检测其左心室射血分数(ejection fraction, EF)。

2.3.2 大鼠拉力值和腓肠肌湿重 将大鼠放在拉力测量仪的抓力板上,待其抓稳后,操作者抓住鼠尾向后牵拉直至大鼠松爪,读数并记录拉力值。取材时,剥离出大鼠左后肢一半腓肠肌,称重并记录。

2.3.3 取材 1%戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠,从腹主动脉获得血液,经过低温和常温离心后分别获得血清和血浆。留取左后肢半片腓肠肌和心脏梗死边缘区组织,分别放入液氮和4%多聚甲醛保存。

2.3.4 ELISA法检测NT-pro BNP、Ang Ⅱ和Ang(1-7)浓度 按照说明书上的操作步骤,根据各样品吸光度OD值和标准曲线,计算各组大鼠NT-pro BNP、Ang Ⅱ和Ang(1-7)的含量。

2.3.5 心肌和腓肠肌病理学观察 取出已固定的心肌和腓肠肌组织,流水冲洗过夜,常规石蜡包埋,心脏组织5 μm切片,腓肠肌组织4 μm切片。用于苏木素伊红(htoxylin eosin, HE)染色的切片,经二甲苯、不同梯度的乙醇脱蜡、水洗,而后进行苏木素、伊红染色、脱水、透明等,最后采用中性树胶封片。应用显微镜采集病理图片,采用Image J软件分析图像。

2.3.6 Western blot检测大鼠腓肠肌中蛋白ACE2、MasR和MyHc的表达 取50 mg腓肠肌组织用600 μL组织裂解液裂解,离心获取上清,采用二喹啉甲酸(bicinchonininc acid,BCA)蛋白浓度测定试剂盒测定样品蛋白总浓度。经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)、电转至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,封闭1 h,含吐温的Tris-HCl缓冲盐溶液(Tris buffered saline with Tween, TBST)洗膜,孵育一抗ACE2(1:1 000)、MasR(1:200)、MyHc(1:1 000)和GAPDH(1:1 000),放入4 ℃冰箱,孵育过夜。次日经过二抗(1:5 000)孵育1 h,加入发光液,在BIO-RAD凝胶成像仪中曝光条带,并分析灰度值。

3 结果

3.1 各组大鼠心脏EF与血清中NT-pro BNP、Ang Ⅱ和Ang(1-7)浓度变化比较

与假手术组比较,模型组大鼠心脏EF值降低(P<0.01),血清中NT-pro BNP浓度显著升高(P<0.01),血浆中Ang Ⅱ的含量升高(P<0.01),而Ang(1-7)的含量显著下降(P<0.01)。应用药物干预后,大鼠心脏EF值和Ang(1-7)的含量得到升高(P<0.01),NT-pro BNP和Ang Ⅱ的浓度明显降低(P<0.01),见表1。

表1 各组大鼠心脏EF与血中NT-pro BNP、Ang Ⅱ和Ang(1-7)浓度变化比较

3.2 大鼠心脏HE染色变化

HE染色显示假手术组大鼠的心肌组织排列规则、组织致密;模型组大鼠的心肌组织排列不规则,部分组织出现肌丝断裂,甚至炎细胞浸润;芪参颗粒和福辛普利干预后,大鼠的心肌组织得到改善,心肌细胞排列相对规则,见图1。

3.3 大鼠的抓力值和腓肠肌湿重变化

与假手术组比较,模型组中大鼠的抓力值和腓肠肌重量都呈现显著降低的趋势(P<0.01),芪参颗粒和福辛普利干预后,两个指标都有所改善(P<0.05),见表2。

表2 各组大鼠抓力值和腓肠肌重量变化比较

3.4 大鼠腓肠肌HE染色变化和肌纤维横截面积情况

假手术组大鼠的腓肠肌HE染色表现为肌纤维的间隔小,肌丝致密,模型组大鼠的腓肠肌肌纤维间距增宽,肌纤维的横截面积显著缩小(P<0.01)。应用药物干预后,腓肠肌的肌纤维间隔变小,肌纤维横截面积增大(P<0.01),见图2、表3。

图2 大鼠心脏HE染色(HE,×200)

表3 大鼠的腓肠肌肌纤维横截面积变化

3.5 大鼠腓肠肌相关蛋白的表达情况

与假手术组比较,模型组腓肠肌组织中ACE2、MasR和MyHc蛋白表达降低(P<0.05);与模型组比较,用药干预后,芪参颗粒组和福辛普利组大鼠腓肠肌组织中ACE2、MasR和MyHc蛋白表达升高(P<0.05),见图3、表4。

注:血管紧张素转化酶2(ACE2),Mas受体(MasR),肌球蛋白重链(MyHc)J.假手术组;M.模型组;Q.芪参颗粒组;F.福辛普利组

表4 大鼠腓肠肌组织中ACE2、MasR和MyHc蛋白表达情况

4 讨论

《中国心血管健康与疾病报告2020》概述显示,2012年到2015年间,全国132家医院13 687名HF患者中,住院患者的病死率为4.1%[13]。随着运动疗法在多种疾病的防治中发挥重要作用,研究者越来越重视骨骼肌在HF病变进展中的作用[14]。HF时,患者骨骼肌的质量及力量均明显下降[15],究其原因,主要在于骨骼肌肌纤维的改变,具体表现为肌纤维横截面积变小,具备抗疲劳能力的I型肌纤维数量减少,而相对易出现疲劳的Ⅱ型肌纤维数量增加[16]。HF患者心功能会随着骨骼肌质量的下降而恶化,造成其生活质量低下[5]。研究发现,在射血分数降低的HF患者中,伴有四肢骨骼肌含量降低的患者在1年内的全因死亡率显著增加[17]。迄今为止,由于对HF合并骨骼肌萎缩的发病机制尚未完全明确,也没有专门针对骨骼肌萎缩或恢复其健康的治疗方法[18]。目前,大多数学者主要从营养[19]、药物[20]和运动医学[21]三个领域研究HF合并骨骼肌萎缩,其中运动干预被认为是目前治疗HF合并骨骼肌萎缩有效且临床证据相对充分的方法[2]。流行病学证据显示,运动训练虽然可以降低心血管疾病的风险,但是HF患者运动能力和运动耐力也受到了限制,患者如果对运动训练的强度和时间掌控欠佳,通过运动训练改善骨骼肌功能就会存在一定问题。由此可见,探寻既能防治HF,又能改善骨骼肌萎缩的药物显得尤其重要。

本实验中结扎大鼠左冠脉前降支,建立心梗后心衰模型,12周后发现模型组大鼠心脏EF值显著降低,而血清中NT-pro BNP浓度升高,心肌组织排列不规则;同时大鼠拉力值降低,腓肠肌重量减轻,肌纤维的截面积减小,MyHc表达下降,以上数据提示大鼠不仅出现HF,还存在骨骼肌萎缩。芪参颗粒和福辛普利能明显改善大鼠心脏的结构和功能,同时抑制骨骼肌的萎缩。

研究提示RAS不仅能调控心肌成纤维外基质代谢[22],还能调控骨骼肌的病变过程[6]。研究者发现Ang Ⅱ能激活泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome system,UPS),造成关键酶肌肉环指蛋白(muscle rring-finger protein,MuRF)-1和F-box蛋白(muscle atrophy f-box,MAFbx)的表达升高,最终导致肌蛋白降解增加和骨骼肌萎缩[23]。与AngⅡ作用相反的Ang(1-7),与MasR结合后发挥保护骨骼肌的作用,表现为抑制肌强度、纤维直径和肌球蛋白重链水平的下降,抑制肌蛋白的降解和骨骼肌萎缩[24-25]。本实验中,模型组大鼠血浆中Ang Ⅱ升高,Ang(1-7)降低,腓肠肌组织中ACE2、Mas R和MyHc蛋白表达降低。应用芪参颗粒和福辛普利后,大鼠血浆中Ang Ⅱ浓度降低,Ang(1-7)含量和ACE2、MasR和MyHc蛋白表达都升高,表明药物能调控RAS平衡来防治HF合并骨骼肌萎缩。

HF的证候类型复杂,气虚、血瘀是其最常见的证候要素,在此基础上形成了益气活血的治则。心气亏虚导致推动无力,表现为血瘀之证;血脉瘀滞,久而化毒犯心,损伤心之阳气,从而加重HF。因此,益气活血治疗HF的同时,当须辅以解毒,尤其是清热解毒,更能契合病机。基于此,课题组在益气活血的治则上加入解毒理念,提出了治疗HF的有效复方——芪参颗粒。前期研究发现该方能改善HF大鼠疲劳症状[9],其他研究发现,方中黄芪可以延缓多种疾病导致的骨骼肌萎缩[26-28],这些药物有效作用的研究为我们进一步探讨芪参颗粒防治HF合并骨骼肌萎缩提供了实验依据。

本实验发现,芪参颗粒能调控经典与非经典RAS途径的平衡,从而发挥对心功能和骨骼肌的双重改善作用。然而该方中到底是什么药物成分发挥效应尚未明确,今后研究中将进一步结合网络药理学和转录组学,挖掘起效成分和对应靶标。